Mikrotechnische Geräte ermöglichen lange

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5006 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Dynamik und Konnektivität neuronaler Schaltkreise ändert sich kontinuierlich in Zeitskalen, die von Millisekunden bis zum Leben eines Tieres reichen. Um biologische Netzwerke zu verstehen, sind daher minimalinvasive Methoden erforderlich, um diese bei sich verhaltenden Tieren wiederholt zu erfassen. Hier beschreiben wir eine Reihe von Geräten, die langfristige optische Aufzeichnungen des ventralen Nervenstrangs (VNC) der erwachsenen Drosophila melanogaster ermöglichen. Diese bestehen aus transparenten, nummerierten Fenstern zum Ersetzen des Brust-Exoskeletts, nachgiebigen Implantaten zum Verschieben innerer Organe, einem Präzisionsarm zur Unterstützung der Implantation und einem schwenkbaren Tisch zum wiederholten Anbinden von Fliegen. Um unser Toolkit zu validieren und zu veranschaulichen, zeigen wir (i) minimale Auswirkungen auf das Verhalten und Überleben der Tiere, (ii) verfolgen den Abbau der mechanosensorischen Nervenenden chordotonaler Organe über Wochen nach der Beinamputation und (iii) decken Wellen neuronaler Aktivität bei der Aufnahme von Koffein auf. Somit eröffnet unser Toolkit zur Langzeitbildgebung die Untersuchung prämotorischer und motorischer Schaltkreisanpassungen als Reaktion auf Verletzungen, Medikamenteneinnahme, Alterung, Lernen und Krankheit.

Nervengewebe sind bemerkenswert plastisch und passen sich an Veränderungen der inneren Zustände und als Reaktion auf die wiederholte Einwirkung wichtiger Umweltreize an. In den Neurowissenschaften stützen sich physiologische Studien zu Langzeitphänomenen, einschließlich Gedächtnisbildung und Neurodegeneration, oft auf den Vergleich von Daten, die zu mehreren Zeitpunkten gesammelt wurden. Allerdings leidet die Quantifizierung von Unterschieden zwischen verschiedenen Bedingungen mit diesem Ansatz unter der interindividuellen Variabilität. Daher wären Längsschnittaufnahmen desselben Tieres ideal, um adaptive Veränderungen in der funktionellen und strukturellen Dynamik neuronaler Schaltkreise aufzudecken. Um Langzeitstudien an einzelnen Tieren durchzuführen, müssen wichtige technische Herausforderungen bewältigt werden, einschließlich der Minimierung experimenteller Beeinträchtigungen.

Mit dem Aufkommen mikroskopischer neuronaler Aufzeichnungen, insbesondere der Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung1, ist es möglich geworden, Gehirnschaltkreise in vivo auf minimalinvasive Weise durch den Einsatz chronischer Geräte chronisch aufzuzeichnen. Beispielsweise wurden kraniale Fenstertechnologien zunächst für die Untersuchung des Neokortex von Mäusen entwickelt2 und seitdem verbessert, um größere3 und tiefere4 Sichtfelder der Bildgebung sowie Aufzeichnungen mit längerer Dauer5 zu erfassen. Ähnlich wie bei Nagetieren kann die Bildgebung des Gehirns auch bei der sich verhaltenden erwachsenen Fliege Drosophila melanogaster6,7 durchgeführt werden, einem beliebten Modellorganismus, der (i) genetisch lenkbar ist, (ii) ein kleines Nervensystem mit viel weniger Neuronen als Nagetiere hat und ( iii) erzeugt komplexe soziale, Navigations- und motorische Verhaltensweisen8,9,10,11.

Jüngste Ansätze haben langfristige chronische Aufzeichnungen von Neuronen im Fliegengehirn ermöglicht12,13,14. Ähnlich wie bei der Abbildung des Neokortex von Nagetieren mit einem Schädelfenster15 kann das Fliegengehirn optisch zugänglich gemacht werden, indem die Kutikula der Kopfkapsel und das darunter liegende Gewebe entfernt werden6. Für eine langfristige oder wiederholte Bildgebung kann dieses Loch dann mit UV-härtendem Kleber13, Zweikomponenten-Silikon16 oder manuell geschnittenem Deckglas12 abgedeckt werden. Die zur Langzeitbildgebung im Gehirn von Mäusen und Fliegen verwendeten Techniken und Technologien eignen sich jedoch nicht zur Aufzeichnung motorischer Schaltkreise im Rückenmark von Säugetieren oder im ventralen Nervenstrang (VNC) von Insekten. Wie das Rückenmark, das durch Wirbelknochen, Muskeln und die Rückenschicht verdeckt ist17, erfordert der optische Zugang zum VNC die Entfernung mehrerer darüber liegender Organe und Gewebe, einschließlich der Flugmuskeln, Fettkörper, des Darms und der Luftröhre. Bei invasiven Eingriffen am Rückenmark ist die Implantation einer Kammer18 oder einer Klemme19 möglich. Die geringe Größe der Fliege schränkt jedoch die Verwendung herkömmlicher implantierbarer Geräte ein und stellt eine große Herausforderung dar, allgemeine Prinzipien für die motorische Kontrolle durch die Untersuchung des experimentell lenkbaren VNC aufzudecken – einem Nervengewebe, das grob organisiert ist wie das Rückenmark von Säugetieren20 und deren Kontrollprinzipien denen von Wirbeltieren ähneln21,22.

Wir haben kürzlich einen Dissektionsansatz entwickelt, der einen optischen Zugang zum VNC bei angebundenen, sich verhaltenden Tieren ermöglicht, indem darüberliegendes Gewebe chirurgisch und genetisch – im Fall der indirekten Flugmuskulatur – entfernt wird23. Diese Technik ist jedoch invasiv, erfordert die Resektion von Brustorganen und lässt die Brusthöhle während der Bildgebung offen. Damit sind Aufnahmen ausgeschlossen, die länger als ein paar Stunden dauern. Folglich war es unmöglich, wiederholte Messungen der Vormotor- und Motorschaltkreise im selben Flug durchzuführen, um Aufschluss darüber zu geben, wie sich diese Schaltkreise im Laufe der Zeit anpassen. Vorhandene Werkzeuge zur langfristigen Bildgebung des Gehirns reichen für die langfristige VNC-Bildgebung nicht aus. Anders als bei der Bildgebung des Gehirns kann man nach der Präparation keine Deckgläser kleben13 oder manuell zuschneiden12, um das Thoraxloch abzudecken. Stattdessen ist ein präziserer, reproduzierbarer Ansatz erforderlich, der sicherstellt, dass keine Hämolymphe aus dem Thorax austritt. Um optischen Zugang zum VNC zu erhalten, müssen darüber hinaus große, darüber liegende Brustorgane und -gewebe sanft, aber sicher verdrängt werden, ohne deren Funktion zu beeinträchtigen.

Hier beschreiben wir eine Reihe mikrotechnischer Geräte, die alle diese Herausforderungen bewältigen und langfristige und wiederholte Aufzeichnungen des Drosophila-VNC über mehr als einen Monat ermöglichen. Diese Geräte bewältigen die besonderen Herausforderungen, die mit der Untersuchung kleiner Modellorganismen (die Fliege ist ca. 2–3 mm lang) verbunden sind und eine äußerst sanfte Handhabung erfordern. Konkret haben wir (i) einen Manipulator („Arm“) entwickelt, der es uns ermöglicht, Brustorgane zur Seite zu bewegen und vorübergehend an Ort und Stelle zu halten, (ii) flexible Implantate, die die chirurgische Entfernung von Brustorganen überflüssig machen, um optischen Zugang zum VNC zu erhalten, (iii) ein transparentes Polymerfenster, das die Brusthöhle umschließt und nummeriert ist, um die Unterscheidung einzelner Fliegen über Bildgebungssitzungen hinweg zu ermöglichen, und (iv) eine Wiedermontagebühne zum sanften, aber festen Anbinden der Fliegen für wiederholte Aufnahmen. Wir bieten detaillierte Beschreibungen zur Herstellung und Verwendung all dieser Tools, um ihre Replikation und Übernahme durch andere Labore zu erleichtern.

Wir zeigen, dass Implantate und Fenster nur minimale Auswirkungen auf das Überleben und die Fortbewegung der Tiere haben und dass sie neuronale Aufzeichnungen über mindestens einen Monat ermöglichen. Anschließend veranschaulichen wir Anwendungsfälle unseres Langzeit-Bildgebungs-Toolkits in zwei Proof-of-Concept-Studien. Zunächst messen wir in Längsrichtung den Abbau der mechanosensorischen Neuroneninnervation der Extremitäten des VNC während zwei Wochen nach der Beinentfernung. Zweitens veranschaulichen wir, wie man – indem man die Brustorgane intakt lässt – die Auswirkungen der Medikamenteneinnahme auf die Dynamik neuronaler Populationen messen kann. Somit ermöglicht unser Langzeit-Thorax-Bildgebungs-Toolkit die wiederholte Längsschnittuntersuchung der strukturellen und funktionellen neuronalen Dynamik in prämotorischen und motorischen Schaltkreisen. Diese Werkzeuge können allgemeiner auch zur Untersuchung anderer Brustgewebe verwendet werden, einschließlich der indirekten Flugmuskulatur, des Darms und der Luftröhre.

Wir haben mikrotechnische Geräte und zugehörige Mikromanipulationsprotokolle entwickelt, die den optischen Zugriff auf den VNC der Fliege für mehr als einen Monat ermöglichen. Implantierte Fliegen weisen keine offensichtlichen Defizite in ihrer Fähigkeit auf, sich zu ernähren, zu gehen, Eier zu legen oder mit anderen zu interagieren. (Abb. 1a und Zusatzfilm 1). Der optische Zugang hängt von zwei Hauptkomponenten ab: einem nachgiebigen und transparenten Implantat (Abb. 1b) und einem transparenten Thoraxfenster (Abb. 1c). Die Herstellung von Fenstern muss reproduzierbar sein und sie müssen groß genug sein, um die Thoraxöffnung sicher abzudichten und so ein Austreten von Hämolymphe zu verhindern. Für die Langzeitbildgebung des Gehirns entwickelte Lösungen wie die Versiegelung mit UV-härtendem Kleber13 oder einem manuell geschnittenen Stück Deckglas12 lösen diese Herausforderungen nicht. Wir haben ein individuelles Fenster mithilfe eines biokompatiblen Polymers, SU-8, durch Fotolithographie entworfen und mikrogefertigt (ergänzende Abbildung 1). Da für die Langzeitbildgebung des Gehirns keine Implantate erforderlich sind, mussten diese neu und ohne Inspiration früherer Ansätze entwickelt werden. Unsere frühesten Implantate waren starre Strukturen, die die interessierenden Regionen (ROIs) der VNC-Bildgebung vor einer Okklusion durch Brustgewebe schützen sollten (ergänzende Abbildung 2, „Iterationen 1 und 2“). Spätere Iterationen versuchten, Brustfenster mit Schutzsäulen zu kombinieren (ergänzende Abbildung 2, „Iterationen 3 und 4“). Allerdings erbrachten beide ersten Prototypen unerschwinglich niedrige Überlebensraten. Der Durchbruch gelang uns mit einem völlig anderen Ansatz: Wir entwarfen nachgiebige (polymerbasierte), mechanisch komprimierbare V-förmige Implantate. Durch mehrere Iterationen und Tests haben wir uns auf die spezifische Größe und den Winkel dieser Implantate geeinigt, was zu einer sehr hohen Überlebensrate nach der Implantation führte. Wir haben diese Implantate in großen Mengen mithilfe der Soft-Lithographie hergestellt, einer Technik, die auf Rapid Prototyping und Replica Molding basiert (ergänzende Abbildungen 3 und 4).

a Implantierte erwachsene Fliegen können in komplexen Umgebungen gezüchtet werden. Ein implantiertes Tier – siehe dorsales Brustfenster (schwarzer Pfeil) – interagiert mit einem nicht implantierten Tier. Der Maßstabsbalken beträgt 0,5 mm. b Ein mechanisch nachgiebiges, transparentes Implantat, mikrogefertigt aus Ostemer 220. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. c Ein nummeriertes, transparentes Brustfenster, mikrogefertigt aus SU-8. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. d Zur Implantation wird ein Tier im Rahmen einer Präparationsphase mit dem Brustkorb voran in ein Loch in einer Stahlunterlage montiert. e Eine mehrstufige Präparation ermöglicht einen langfristigen optischen Zugang zum ventralen Nervenstrang (VNC). Links In die dorsale Brustkutikula wird ein Loch geschnitten, das den Proventriculus (Gelb), die Luftröhre (Cyan) und die Speicheldrüse (Magenta) freilegt, die über dem ventralen Nervenstrang (VNC, dunkelblau) liegen. Die indirekten Flugmuskeln (IFMs) wurden durch gewebespezifische Expression von Reaper (Act88F:Rpr)23 abgebaut.Dann werden mithilfe eines speziell entwickelten Manipulatorarms die Brustorgane verschoben, wodurch der VNC sichtbar wird. Mitte Anschließend wird das Implantat in einer schmalen, mechanisch geschlossenen Konfiguration in dieses Brustloch eingesetzt. rechts Der Arm wird entfernt und das Implantat wird freigegeben, wodurch es sich öffnet und die Organe, die den VNC bedecken, mechanisch zur Seite schiebt. Abschließend wird ein transparentes Fenster versiegelt, um das Brustloch zu verschließen. f Eine 3D-Nanodruck-Remontagebühne ermöglicht das Auf- und Absteigen von Tieren für wiederholte Zwei-Photonen-Bildgebung. links Der monolithische Mechanismus wird über ein nachgiebiges Scharnier betätigt. rechts Beispielbild eines an der Wiederaufstiegsbühne angebundenen Tieres, von oben gesehen. g Implantierte Tiere, die an den Wiedermontagetisch angebunden sind, werden unter ein Zwei-Photonen-Mikroskop gelegt, das von einem Kameraarray umgeben ist. Diese Konfiguration ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung neuronaler Aktivität und Tierverhalten. Der Einschub zeigt ein Kamerabild, überlagert mit Deep-Learning-basierten 2D-Posen, die mit DeepFly3D25 geschätzt wurden. h (obere Reihe) Der dorsale Brustkorb eines implantierten Tieres, gesehen unter dem Dissektionsmikroskop, und (untere Reihe) sein VNC, visualisiert mithilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Dieses Tier exprimiert GFP im gesamten Nervensystem und wird links mit 3 dpi, in der Mitte mit 14 dpi und rechts mit 28 dpi aufgezeichnet. Z-Stapel sind tiefenfarbcodiert (100 μm). Der Maßstabsbalken beträgt 25 μm.

Um diese Werkzeuge zu verwenden, haben wir ein Manipulationsprotokoll entwickelt, das im Zusatzfilm 2 dargestellt ist. Kurz gesagt, montieren wir Tiere zunächst mit UV-härtbarem Kleber auf einer chirurgischen Dissektionsbühne (Abb. 1d)23. Als nächstes schneiden wir mit einer 30G-Spritzennadel ein quadratisches Loch in die dorsale Nagelhaut (Abb. 1e – linkes Feld). Anschließend werden die indirekten Flugmuskeln (IFMs) entfernt, um eine thorakale Öffnung für das Implantat zu schaffen. Um die Auswirkungen der Mikrochirurgie zu minimieren, arbeiten wir mit Tieren, die das Apoptose-induzierende Protein Reaper exprimieren, insbesondere in IFMs (Act88F:Rpr). Das Abpumpen von Reaper führt zu einem schnellen Abbau des Muskelgewebes23, dessen Rest leicht mit der Spritzennadel entfernt werden kann. Diese genetische Linie ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, um diese Werkzeuge nutzen zu können. Nachdem wir das Brustgewebe freigelegt haben, lösen wir mit einer feinen Glasnadel und einer Pinzette einseitig die Trachealfasern ab, die den Darm und die linke Speicheldrüse verbinden. Wir haben einen maßgeschneiderten Manipulationsarm entworfen (ergänzende Abbildung 5), um innere Organe – Darm, Speicheldrüse und Luftröhre – auf die rechte Seite der Brusthöhle zu drücken (Abb. 1e – linkes Feld). Dies ermöglicht es, das Implantat im geschlossenen Zustand in die neu zugängliche Brusthöhle einzuführen (Abb. 1e – mittleres Bild und ergänzende Abb. 4). Nach der Freigabe öffnet sich das Implantat allmählich und hält die Organe an der Brustwand, nachdem der Manipulationsarm zurückgezogen wurde (Abb. 1e – rechtes Feld). Wir verschließen die freigelegte Brusthöhle, indem wir ein transparentes Polymerfenster auf die Kutikula kleben (Abb. 1e – rechtes Feld). Auf der Oberfläche dieser Fenster sind eindeutige Nummern eingraviert, die es ermöglichen, implantierte Tiere zu identifizieren und zu unterscheiden. Anschließend können wir Tiere abtrennen, indem wir den UV-härtbaren Kleber entfernen, der das Schildchen bis zum Präparierstadium hält, sodass sie sich frei bewegen können.

Um das wiederholte, sanfte Anbinden implantierter Fliegen zu erleichtern, haben wir mithilfe der Zwei-Photonen-Polymerisation eine Wiedermontagephase (Abb. 1f und ergänzende Abb. 6) gedruckt. Dieser Herstellungsprozess verfügt über die erforderliche Genauigkeit, um 3D-Merkmale herzustellen, die Tiere zuverlässig an Ort und Stelle halten. Im montierten Zustand untersuchten wir Tiere mit einem Zwei-Photonen-Mikroskopsystem, das von einem Array aus mehreren Kameras umgeben war. Dieses System ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung neuronaler Aktivität im VNC23 sowie die markerlose 3D-Körperteilverfolgung25 (Abb. 1g). In den allermeisten Fällen war unser Implantationsprotokoll erfolgreich. In seltenen Fällen zeigten implantierte Tiere spezifische Bewegungen des Atmungs- oder Verdauungsgewebes, die den VNC während der Bildgebung verschließen könnten (ergänzende Abbildung 7). Eine erfolgreiche Implantation ermöglichte einen optischen Zugang zum VNC, der über einen Monat hinweg weitgehend unverändert blieb. Dies ermöglichte wiederholte Untersuchungen der Struktur (Abb. 1h und Zusatzfilm 3) und der Funktionsdynamik neuronaler Populationen bei weiblichen (Zusatzfilm 4) und männlichen (Zusatzfilm 5) Fliegen. Unsere Langzeitaufzeichnungstools könnten auch zur Aufzeichnung genetisch identifizierbarer Neuronenpaare eingesetzt werden. Wir veranschaulichen dies, indem wir die Aktivität eines Paares absteigender DNa01-Neuronen über drei Tage hinweg abbilden – 1, 3 und 5 Tage nach der Implantation (dpi)). Diese Aktivität korreliert mit dem Drehen des Bewegungsapparats 23 (Ergänzungsabbildung 8 und Ergänzungsfilm 6). Obwohl wir uns hier darauf konzentrierten, optischen Zugang zum zervikalen Binde- und Prothorakal-Neuromer (T1) des VNC zu erhalten (Abb. 1h), ist unser Ansatz allgemein und ermöglicht die Neugestaltung und Mikrofertigung von Implantaten, die die Abbildung anderer Regionen des VNC ermöglichen. Als Proof-of-Concept haben wir ein Implantat modifiziert, das es ermöglicht, Gewebe im hinteren Thorax zurückzuhalten und optischen Zugang zu T2- und T3-Neuromern zu erhalten (ergänzende Abbildung 9).

Um unseren Ansatz zur Langzeitaufzeichnung zu validieren, haben wir zunächst die möglichen Auswirkungen der Implantation auf die Lebensdauer untersucht. Konkret haben wir die Lebenserwartung von drei Gruppen von Tieren gemessen (n = 40 pro Gruppe): (i) Fliegen, die nicht manipuliert wurden („Intakt“), (ii) Tiere, die eine Kaltanästhesie überstanden haben und auf die Sektionsbühne und den Flügel aufgestiegen sind Entfernung („Scheinimplantation“) oder (iii) Fliegen, die sich dem vollständigen Implantationsverfahren unterzogen haben („Implantiert“). Bei diesem Experiment überlebten 73 % der implantierten Tiere mehr als 4 Stunden nach der Operation. Da der chirurgische Eingriff und die Implantation einer einzelnen Fliege vom Anfang bis zum Ende etwa 40 Minuten dauern, betrug der Gesamtdurchsatz – eine Kombination aus dieser Implantationszeit und der akuten Überlebensrate – ein implantiertes Tier pro 55 Minuten. Bei Fliegen, die mehr als 4 Stunden nach der Implantation überlebten, beobachteten wir eine maximale Überlebenszeit von bis zu 88 Tagen. Allerdings zeigten implantierte Fliegen in den ersten Tagen nach der Implantation eine höhere Mortalität als intakte Tiere (Abb. 2a). Bemerkenswert ist, dass scheinimplantierte Fliegen in den ersten Tagen ebenfalls eine erhöhte Mortalität aufwiesen, was darauf hindeutet, dass der Umgang mit Tieren vor der Implantation und nicht die Implantation selbst für die erhöhte Mortalität verantwortlich war. Wir erzielten ähnliche Überlebensraten für implantierte und intakte männliche Fliegen, die über einen Zeitraum von 20 Tagen untersucht wurden (ergänzende Abbildung 10a).

a Überlebenskurven für genetisch identische Geschwistertiere, die (i) nicht experimentell manipuliert wurden (grün, „Intakt“), (ii) angebunden waren, kalt betäubt wurden und denen die Flügel entfernt wurden (blau, „Scheinimplantation“) oder (iii ) durch Implantation und Hinzufügung eines Thoraxfensters (orange, „Implantiert“) für die Langzeitbildgebung vorbereitet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b Die Verhaltensweisen wurden durch Analyse der Dynamik des optogenetisch aktivierten Rückwärtsgehens innerhalb einer abgerundeten, quadratischen Arena verglichen. Die Fortbewegung wurde rechnerisch analysiert und aufgezeichnet und zeigte die anfängliche Vorwärtsbewegungsbahn des Tieres (Cyan) und die anschließende optisch hervorgerufene Rückwärtsbewegungsbahn (lila). c Translationsgeschwindigkeiten von intakten (oben), scheinimplantierten (Mitte) und implantierten (unten) Tieren während 30 s spontanem Verhalten, gefolgt von drei optogenetischen Stimulationsperioden von jeweils 3 s (rosa, „Stim“). Hier haben wir Daten zusammengefasst, die in drei Zeiträumen über einen Monat hinweg aufgezeichnet wurden. Dargestellt sind rohe (grau) und mittlere (blaue) Spuren. Aus diesen Zeitreihen ist jedes Stimulationsereignis ein Datenpunkt, aus dem wir zusammenfassende Statistiken berechnet haben (intakte Gruppe, n = 286 Ereignisse; scheinimplantierte Gruppe, n = 208 Ereignisse; implantierte Gruppe, n = 213 Ereignisse), einschließlich (d) der anfängliche negative Steigung der Translationsgeschwindigkeit – Rückwärtsgehen – bei optogenetischer Stimulation, (e) die über den gesamten optogenetischen Stimulationszeitraum zurückgelegte Rückwärtslaufstrecke und (f) die maximale negative Translationsgeschwindigkeit über den gesamten optogenetischen Stimulationszeitraum. Ein Sternchen (*) zeigt P < 0,05 an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Obwohl die Implantation keinen dramatischen Einfluss auf die Lebenserwartung hatte, kamen wir zu dem Schluss, dass die Platzierung eines mikrogefertigten Objekts im Thorax das Gehen negativ beeinflussen könnte, möglicherweise aufgrund der Störung der Beinmuskulatur oder einfach der zusätzlichen Belastung. Die Untersuchung dieser Möglichkeit ist schwierig, da Fliegen unterschiedliche Gangarten mit unterschiedlichen Laufgeschwindigkeiten und Manövern verwenden26. Um eine quantitative Analyse des Gehens durchführen zu können, haben wir daher das stereotype Rückwärtsgehen durch optogenetische Aktivierung des lichtgesteuerten Kationenkanals CsChrimson27 gesteuert, der in Moonwalker Descending Neurons (MDNs) ausgedrückt wird28,29. Wir haben die Tiere einen Monat lang wiederholt in einer speziell angefertigten Arena (Abb. 2b) stimuliert. Dadurch konnten wir die Laufbahnen von intakten, scheinimplantierten oder implantierten Fliegen quantifizieren und vergleichen. Wir haben zunächst 30 Sekunden lang spontane Verhaltensweisen aufgezeichnet und dann jeweils 3 Sekunden lang drei aufeinanderfolgende Blitze mit orangefarbenem 590-nm-Licht abgegeben (Abb. 2c, rosa und ergänzende Abb. 11a) mit einem Intervall zwischen den Reizen von 10 Sekunden. Diese Experimente wurden an denselben Tieren in drei Zeiträumen über einen Monat hinweg durchgeführt (1–3 Tage nach der Implantation (dpi), 14–16 dpi und 28–30 dpi). Bei der optogenetischen Stimulation beobachteten wir, dass die Tiere einen schnellen Rückwärtsgang erzeugten, der sich allmählich verlangsamte und schnell zur Grundlinie zurückkehrte, als das Licht ausgeschaltet wurde (Zusatzfilm 7). Über alle Aufzeichnungssitzungen hinweg beobachteten wir einen kleinen signifikanten Unterschied in der anfänglichen Rückwärtsbeschleunigung (Abb. 2d) zwischen der intakten Gruppe und der scheinimplantierten Gruppe (P = 0,044 Kruskal-Wallis mit Post-hoc-Conover-Test) und zwischen der „intakten“ Gruppe und die „implantierte“ Gruppe (P = 0,044). Es wurde jedoch kein statistischer Unterschied in den Translationsgeschwindigkeiten von intakten, scheinimplantierten und implantierten Tieren hinsichtlich der gesamten zurückgelegten Rückwärtslaufstrecke (Abb. 2e) und der maximalen Rückwärtslaufgeschwindigkeit (Abb. 2f) beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden beim Vergleich altersbeschränkter Kohorten erzielt. Insbesondere konnten wir bei keiner Alterskohorte einen Unterschied zwischen der intakten und der implantierten Gruppe bei der anfänglichen Rückwärtsbeschleunigung beobachten (1–3 dpi, 14–16 dpi oder 28–30 dpi). Intakte Fliegen hatten eine etwas langsamere Rückwärtsbeschleunigung (dies kann auf den Kontakt zwischen den Beinen und Flügeln zurückzuführen sein, die bei Act88F:Rpr-exprimierenden Tieren durchhängten). Wir stellten einen signifikanten Unterschied zwischen beiden Kontrollgruppen bei 14–16 dpi fest (ergänzende Abbildung 11b, c) für (i) die Steigung der Rückwärtsgangreaktion (P = 0,009), (ii) die zurückgelegte Rückwärtslaufstrecke (P = 0,0008). ) und (iii) die maximale negative Translationsgeschwindigkeit (P = 0,003). Auch das spontane Gehen war bei männlichen implantierten Fliegen im Vergleich zu intakten Fliegen qualitativ unverändert (Zusatzfilm 8). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Fortbewegung durch die Implantation nicht wesentlich beeinträchtigt wird.

Neuronale Schaltkreise behalten während des gesamten Erwachsenenalters die Fähigkeit zur strukturellen Neuordnung30,31. Dies ermöglicht Anpassungen als Reaktion auf Verletzungen des Nervensystems32,33,34 und Schlaganfall35. In ähnlicher Weise reorganisieren sich die Bewegungsabläufe bei Fliegen nach einer Beinamputation36. Die Auswirkungen der Amputation auf die Kontrollkreise der Gliedmaßen bleiben jedoch unerforscht, da zur Aufdeckung dieser Veränderungen eine Bildgebung des VNC amputierter Tiere über Tage oder Wochen hinweg erforderlich ist. Obwohl man im Prinzip stattdessen die Daten mehrerer Tiere an bestimmten Tagen nach der Beinamputation zusammenfassen könnte, weist dies zwei große Mängel auf. Erstens würde die Variabilität zwischen Tieren die Fähigkeit einschränken, die Degeneration spezifischer neuronaler Strukturen zu beheben. Zweitens wäre dieser Ansatz zeitaufwändiger und würde viel mehr Experimente und Tiere pro interessierendem Zeitpunkt erfordern. Im Gegensatz dazu ist die longitudinale Bildgebung ideal geeignet, um dynamische Veränderungen in neuronalen Strukturen mit relativ wenigen Tieren aufzudecken. Um diese Möglichkeit zu veranschaulichen, haben wir den Abbau primärer propriozeptiver mechanosensorischer Afferenzen im VNC nach einer Beinamputation verfolgt. Insbesondere haben wir die Axonenden von amputierten propriozeptiven femoralen chordotonalen Organen des Beins (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) im T1-Neuromer des VNC visualisiert. Die Fliegen wurden am ersten Tag nach der Eklosion (dpe) implantiert. Einen Tag nach der Implantation (1 dpi) führten wir dann eine volumetrische Zwei-Photonen-Bildgebung von T1 durch. Die Volumina bestanden aus 100 Bildern, die in Tiefenintervallen von 1 μm aufgenommen wurden. Dann wurde bei 2 dpi das vordere linke Bein jedes Versuchstiers in der Nähe des Thorax-Coxa-Gelenks amputiert (Abb. 3a).

a Bei Versuchstieren wurde das vordere linke Bein am Thorax-Coxa-Gelenk bei 2 dpi amputiert. b Schematische Darstellung des Nervensystems einer Fliege. Der abgebildete VNC-Bereich ist hervorgehoben (grau). Standardabweichung-Z-Projektion konfokaler Bildgebungsvolumina, die von Fliegen aufgezeichnet wurden, die entweder (c) intakt gelassen oder (d) mit 2 dpi amputiert wurden (nc82-gefärbtes Neuropil grau umrandet; GFP-Fluoreszenz in schwarz). Es wurden Gewebe implantierten Tieren entnommen, denen das linke Vorderbein amputiert worden war. VNC-Gewebe wurde entfernt und mit 20 dpi gefärbt. Die schwarze Pfeilspitze zeigt die VNC-Region an, die den größten Unterschied zwischen intakter und amputierter Propriozeptor-Innervation aufweist. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Maximalintensitätsprojektionen von Z-Stapeln, aufgezeichnet von (e) einem intakten (Kontroll) oder (f) amputierten Tier. Die Daten wurden mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie erfasst. Gezeigt werden Bilder, die mit 1, 2, 4 und 15 dpi aufgenommen wurden. Bilder werden im 1-dpi-Bild registriert. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Weiße Pfeilspitzen weisen auf eine Verschlechterung der Axonenden im VNC amputierter Tiere hin. g, h Fluoreszenz gemessen über Tage hinweg mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie von intakten (n = 5; blaue Dreiecke) oder amputierten Tieren (n = 5; orange-rote Kreise). Die Messungen zeigen die mittlere Fluoreszenz innerhalb der interessierenden Region (g) Cyan oder (h) Lila an (ROI), wie in den Feldern e und f, normalisiert und dividiert durch die mittlere Fluoreszenz bei 1 dpi. Boxplots zeigen den Median sowie das erste und dritte Quartil. Statistische Vergleiche, die mit einem Mann-Whitney-U-Test (zweiseitig) durchgeführt wurden, bei dem ein Sternchen (*) P < 0,05 und zwei Sternchen (**) P < 0,01 angibt. Für Panel g, P = 0,006 (Tag 4); 0,006 (Tag 5); 0,009 (Tag 6); 0,006 (Tag 7); 0,018 (Tag 8); 0,009 (Tag 9); 0,006 (Tag 10); 0,006 (Tag 11); 0,009 (Tag 12); 0,006 (Tag 13); 0,006 (Tag 14); 0,006 (Tag 15). Für Panel h, P = 0,03 (Tag 4); 0,006 (Tag 5); 0,009 (Tag 6); 0,006 (Tag 7); 0,009 (Tag 8); 0,009 (Tag 9); 0,006 (Tag 10); 0,006 (Tag 11); 0,009 (Tag 12); 0,006 (Tag 13); 0,006 (Tag 14); 0,006 (Tag 15). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Implantierte Fliegen tolerierten eine Beinamputation und erzeugten mit den verbleibenden fünf Beinen normales Verhalten (wie in Lit. 36). 15 Tage lang sammelten wir jeden Tag T1-Bildvolumina (Abb. 3b) von Kontrolltieren („Intakt“) und von Tieren, deren linke Vorderbeine entfernt wurden („Amputiert“). Wir führten 18 Tage nach der Beinentfernung eine VNC-Dissektion, -Färbung und eine konfokale Bildgebung durch, um zu bestätigen, dass die mechanosensorische Innervation des T1-Neuromers des VNC bei intakten Tieren bestehen blieb (Abb. 3c), bei amputierten Tieren jedoch abgebaut wurde (Abb. 3d). Eine genaue Untersuchung der Bildvolumina des Zwei-Photonen-Mikroskops ergab, dass es bei Kontrolltieren über Tage hinweg zu einer gewissen Photobleichung im Bildbereich kam (Abb. 3e). Dieser Rückgang der Fluoreszenz war jedoch bei weitem nicht so stark wie der Rückgang des Signals, der in den Axonterminalen des chordotonalen Organs des linken T1-Neuropils amputierter Tiere beobachtet wurde (Abb. 3f; ergänzende Abb. 12 und ergänzender Film 9). Durch die Quantifizierung von Änderungen der Signalintensität innerhalb spezifischer Regionen von Interesse (ROIs) chordotonaler Axoninnervationen innerhalb des VNC 37 haben wir eine hoch reproduzierbare und signifikante Fluoreszenzreduktion bei amputierten gegenüber intakten Tieren gemessen (Mann-Whitney-U-Test, * zeigt P < 0,05 an und). ** zeigt P < 0,01 an) (Abb. 3g, h).

Neuronale Schaltkreise sind nicht nur über Tage und Wochen hinweg morphologisch anpassbar, sondern modulieren ihre Dynamik auch kontinuierlich auf kürzeren Zeitskalen, abhängig vom inneren Zustand eines Tieres. Zu diesen Zuständen gehören bei Drosophila wie auch bei Wirbeltieren Hunger38, Müdigkeit39, sexuelle Erregung40, Aggression41 und defensive Erregung42. Interne Zustände können sich auch nach der Einnahme psychoaktiver Substanzen, einschließlich Koffein, ändern43,44,45. Eine kontinuierliche Überwachung des Nervensystems ist von entscheidender Bedeutung, um herauszufinden, wie sich Schaltkreise während dieser sich ändernden Zustände neu konfigurieren.

Unsere bisherige Technik zur Untersuchung der neuronalen VNC-Dynamik bei sich verhaltenden Tieren23 erforderte die Entfernung großer Darmabschnitte, was die Lebenserwartung der Tiere verkürzte und Langzeitaufzeichnungen, die Veränderungen in inneren Zuständen erfassen, unmöglich machte. Obwohl Geschmacksreaktionen im Gehirn untersucht werden können46, schließt die Entfernung des Darms außerdem die Nahrungsaufnahme aus und erlaubt daher nicht zu untersuchen, wie Sättigung oder die Einnahme psychoaktiver Substanzen die neuronale Dynamik im VNC modulieren. Unser Toolkit zur Langzeitbildgebung schont den Darm und ermöglicht so die Fütterung der Tiere während der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Daher stellten wir uns als nächstes die Frage, inwieweit unsere Technologien genutzt werden könnten, um die Auswirkungen der Medikamenteneinnahme auf die neuronale Dynamik aufzudecken.

Fliegen, die niedrigen Koffeindosen ausgesetzt waren, führten zu vermindertem Schlaf43,44 und erhöhter Bewegungsaktivität45. Hier stellten wir die Frage, inwieweit die Einnahme von Koffein auch globale Veränderungen in der Dynamik neuronaler Populationen bewirken könnte. Um dies zu testen, ließen wir die Tiere zunächst 21–23 Stunden lang hungern, um die Nahrungsaufnahme zu fördern. Dann, nach der Implantation, zeichneten wir die neuronale Aktivität im Halsbindegewebe auf („Vor der Fütterung“). Während die neuronale Aktivität weiterhin aufgezeichnet wurde, wurde den Tieren entweder eine Kontrolllösung („nur Saccharose“) mit 8 mg/ml Saccharose und 1 mg Amaranth-Farbstoff (zur Bestätigung der Fütterung47) (Zusatzfilm 10) oder eine Kontrolllösung (Abb. 4a) gefüttert experimentelle Lösung, die auch 8 mg/ml oder 40 mg/ml Koffein enthielt: „Niedriges Koffein“ (Ergänzungsfilm 11) bzw. „Hoher Koffeingehalt“ (Ergänzungsfilm 12). Wir zeichneten die neuronale Aktivität und das Verhalten die nächsten 38 Minuten lang weiter auf. Die Fütterung wurde durch eine Post-hoc-Bewertung der Bauchfärbung aufgrund der Farbstoffaufnahme bestätigt (Abb. 4b). Während der Bildgebung untersuchten wir die Aktivität aufsteigender und absteigender Neuronen, deren Axone durch die zervikale Verbindung zwischen Gehirn und VNC verlaufen. Zu diesem Zweck führten wir eine Zwei-Photonen-Bildgebung des koronalen Querschnitts des thorakalen Halsbindegewebes durch (Abb. 4c)23 bei Fliegen, die den genetisch kodierten Kalziumindikator GCaMP6f sowie den anatomischen Marker tdTomato im gesamten Nervensystem exprimieren ( Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-opGCaMP6f; UAS-tdTomato/+). Um die beim Verhalten von Tieren auftretende Bildverformung und -translation zu überwinden, haben wir Bilddaten mithilfe eines auf dem optischen Fluss basierenden Algorithmus registriert (siehe Methoden)23. Nach der Bildregistrierung zeigen unsere koronalen Bildgebungsdaten die Aktivität von Axonen, die zu absteigenden Neuronen gehören, die Aktionen steuern48,49, und von aufsteigenden Neuronen, die laufende Verhaltenszustände an das Gehirn übermitteln50. Diese Axone sind in unseren Zwei-Photonen-Mikroskopiebildern als Ellipsen erkennbar (Abb. 4d, weiße Pfeilspitzen). Diese panneuronalen Regionen von Interesse (ROIs) stimmen mit denen überein, die wir bei der Abbildung der neuronalen Aktivität in sehr spärlichen Sätzen absteigender23 und aufsteigender50 Neuronen beobachtet haben. Dies ist am deutlichsten bei dem Paar großer absteigender Neuronenaxone der Riesenfaser zu erkennen,51 die durch die dorsale Mittellinie des zervikalen Bindegewebes verlaufen (Abb. 4d, weiße Sternchen).

a Digitale Darstellung einer Fliege, die gefüttert wird, während Neuronen mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop aufgezeichnet werden. b Foto eines implantierten Tieres nach Einnahme einer hochkonzentrierten Koffeinlösung während der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die weiße Pfeilspitze weist auf eine violette Färbung des Abdomens hin und bestätigt die Verdauung einer mit Amaranth-Farbstoff vermischten Koffein-Saccharose-Lösung. c Schematische Darstellung des ventralen Nervenstrangs, der die Abbildungsregion im Nackenbindebereich anzeigt. d Farbcodierte mittlere Nervenaktivität während aller nicht-lokomotorischen Perioden für eine Fliege vor der Nahrungsaufnahme (dieselben Daten wie oben in f), einschließlich Anmerkungen zu einzelnen Axonen, die durch das Halsbindemittel verlaufen (Pfeilspitzen). Sternchen geben die Position der Riesenfaseraxone an. e Normalisierte Fluoreszenz über alle Axone, die während 4-minütiger Aufzeichnungen durch das Brust-Hals-Konnektiv verlaufen, entweder vor (blau), während (grün), kurz nach (orange) oder lange nach (rot) der Nahrungsaufnahme. Fliegen wurden mit einer Lösung gefüttert, die entweder nur Saccharose (links), Saccharose und eine niedrige Dosis (Mitte) oder eine hohe Dosis Koffein (rechts) enthielt. f Farbcodierte mittlere neuronale Aktivität während aller nicht-lokomotorischen Perioden für eine Fliege, entweder vor (oben), unmittelbar nach (Mitte) oder lange nach (unten) der Einnahme einer hochkonzentrierten Koffeinlösung. g Statistische Analyse, die das Vorhandensein von Aktivitätswellen anzeigt. Die neuronale Aktivität wird mithilfe von Parametern normalisiert, die anhand der Aktivität vor der Fütterung berechnet werden (Methoden). Die maximale normalisierte Aktivität wird für drei Fliegen pro Bedingung vor, während und nach der Fütterung angezeigt. Die maximale Aktivität ist erst > 29 Minuten nach der Fütterung mit einer hochkonzentrierten Koffeinlösung signifikant erhöht (einseitiger Mann-Whitney-U-Test, * zeigt P < 0,05 an, P = 0,04 für beide * angegeben, ns bedeutet nicht signifikant). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. h Das zervikale Bindegewebe eines implantierten Tieres ist in vier interessierende Regionen (ROIs) segmentiert. Diese werden einem Zeitprojektionsbild mit Standardabweichung überlagert. i Die neuronale Aktivität normalisierte sich während einer Aktivitätswelle auf die maximale Fluoreszenz. Spuren sind wie in Tafel h farblich gekennzeichnet. Der Peak der mittleren Fluoreszenz in allen Regionen liegt bei 0 s. j Pixelweise Zeit der Spitzenaktivität. Der Spitzenwert der mittleren Aktivität über das gesamte Halsbindegewebe wurde auf 0 s festgelegt.

Unter allen drei Versuchsbedingungen – vor, während und kurz nach der Fütterung – beobachteten wir Schwankungen der neuronalen Aktivität, die mit den Gehepochen verbunden waren (Abb. 4e, blaue, grüne und orangefarbene Spuren; ergänzende Abb. 13c, Fly 7 und ergänzende). Filme 10–12). Allerdings beobachteten wir mehr als 29 Minuten nach der Fütterung große Aktivitätswellen, die nur bei Fliegen beobachtet wurden, denen die hochkonzentrierte Koffeinlösung verabreicht wurde (Abb. 4e, rote Spuren). Die Amplitude der Wellen war viel größer als die mit spontaner Fortbewegung einhergehenden Schwankungen der Nervenaktivität. Aktivitätswellen breiteten sich über das gesamte Bindegewebe aus (Abb. 4f) und waren mit einer insgesamt starren Haltung verbunden, die von Mikrobewegungen begleitet wurde (Zusatzfilm 13). Um das Vorhandensein und die Amplitude von Wellen zu verschiedenen Zeitpunkten und zwischen Versuchsbedingungen zu quantifizieren, normalisierten wir die neuronale Aktivität im gesamten Halsbindegewebe im Vergleich zu der Aktivität, die vor dem Füttern für jede Fliege beobachtet wurde. Anschließend berechneten wir die maximale normalisierte Fluoreszenz (obere Grenze des 99 %-Perzentils) für Zeiträume vor, während und nach der Fütterung. Bis zu ca. 29 Minuten nach der Fütterung unterschied sich das maximale Aktivitätsniveau von Fliegen, die mit einer hohen Koffeinkonzentration gefüttert wurden, nicht signifikant von denen von Fliegen, die mit Saccharose oder einer Lösung mit niedrigem Koffeingehalt gefüttert wurden (Mann-Whitney-U-Tests, P > 0,05). Im Gegensatz dazu war zwischen 29 und 38 Minuten nach der Fütterung die maximale Aktivität jeder Fliege, die mit einer Lösung mit hohem Koffeingehalt gefüttert wurde, aufgrund der Welle neuronaler Aktivität signifikant höher als unter den anderen Bedingungen (Mann-Whitney-U-Tests, P = 0,040) (Abb . 4g). Auch die zeitliche Entwicklung dieser Wellen war reproduzierbar: Die Aktivität begann im dorsalmedialen (blau), dann dorsolateralen (grün) und schließlich ventralen (orange) Konnektiv. Die Riesenfaserneuronen (rot)51 waren die letzten, die über längere Zeiträume aktiv wurden und eine hohe Aktivität aufrechterhielten (Abb. 4h – j und ergänzende Abb. 13d – i). Diese Daten veranschaulichen, dass unser Toolkit zur Langzeitbildgebung verwendet werden kann, um zu untersuchen, wie die Einnahme von Nahrungsmitteln oder Medikamenten interne Zustände und die globale neuronale Dynamik beeinflusst.

Hier haben wir mikrotechnische Geräte beschrieben, die eine umfassende und longitudinale Untersuchung der motorischen Kontrolle bei sich verhaltenden Tieren ermöglichen. Insbesondere ermöglichen wir langfristige Zwei-Photonen-Aufzeichnungen von Geweben im Brustkorb erwachsener Drosophila, einschließlich prämotorischer, sensorischer und motorischer Schaltkreise, die auf den VNC abzielen und sich dort befinden. Unser Toolkit ist darauf ausgelegt, die einzigartigen Herausforderungen der Langzeitaufzeichnung des VNC im Gegensatz zu einfacheren Ansätzen zu bewältigen, die Längsaufzeichnungen von Neuronen im Gehirn ermöglichen12,13: Es besteht aus (i) einem Mikromanipulatorarm, (ii) einem Polymer- basiertes weiches Implantat zur Verschiebung von Brustorganen, (iii) ein nummeriertes, transparentes Polymerfenster, das auf reproduzierbare Weise hergestellt werden kann, um die Brustöffnung abzudichten, und (iv) eine nachgiebige Anbindestufe, die eine sanfte, wiederholte Befestigung um den Brustkorb von Tieren ermöglicht für Zwei-Photonen-Bildgebung. Zusammen erweitern diese Tools das Zeitfenster für die neuronale Aufzeichnung von nur wenigen Stunden23 auf mehr als einen Monat, ohne die Lebensdauer implantierter Tiere deutlich zu verkürzen oder ihr Bewegungsverhalten wesentlich zu stören. Wir haben mehrere Anwendungsfälle für unseren langfristigen Bildgebungsansatz veranschaulicht, darunter (i) wochenlange Aufzeichnungen der neuronalen Morphologie, panneuronalen Aktivität und spärlichen neuronalen Aktivität, (ii) wochenlange Verschlechterung der Projektionen sensorischer Neuronen der Gliedmaßen auf den VNC von einem amputierten Glied und (iii) globale Veränderungen der neuronalen Aktivität nach der Einnahme von Medikamenten.

Unsere Langlebigkeitsexperimente bestätigten, dass die Lebensdauer implantierter Fliegen derjenigen von intakten Tieren ähnelte. Allerdings waren die Überlebenskurven für implantierte und scheinimplantierte Fliegen aufgrund der übermäßigen Sterblichkeit in den ersten Tagen nach der Operation verschoben. Dies deutet darauf hin, dass diese anfänglichen Verluste möglicherweise auf chirurgische Eingriffe zurückzuführen sind und nicht speziell mit der Implantation zusammenhängen. In Übereinstimmung damit zeigten unsere Studien zum Rückwärtsgehen keine eindeutigen Veränderungen in den Bewegungsmetriken zwischen Kontrolltieren und implantierten Tieren. In Zukunft wäre es jedoch wichtig, die minimalen Auswirkungen der Implantation auf komplexere Verhaltensweisen wie Balz und Lückenüberschreitung zu bestätigen.

In einer ersten Fallstudie unseres Toolkits untersuchten wir die anatomische Verschlechterung chordotonaler Projektionen zum VNC über einen Zeitraum von zwei Wochen nach der Beinamputation. Dort beobachteten wir in der ersten Woche nach der Amputation einen deutlichen Abbau der mechanosensorischen Neuronenenden. Die zeitliche Entwicklung dieses Abbaus war in allen ROIs heterogen, was mit der Existenz unterschiedlicher chordotonaler Zellpopulationen 37 übereinstimmt, die möglicherweise unterschiedliche Robustheitsgrade gegenüber dem Abbau aufweisen. Alternativ könnten einige Terminals über aufsteigende Vorsprünge von T2 (Mittelbein) oder T3 (Hinterbein) entstehen und daher nicht direkt von der Vorderbeinamputation betroffen sein. Drosophila wurde zuvor in zahlreichen Studien als Modell für Nervenverletzungen verwendet52, wobei gezeigt wurde, dass der axonale Abbau nach einer Verletzung der Waller-Degeneration bei Säugetieren ähneln kann53. Daher könnte unser Langzeit-Bildgebungs-Toolkit in Zukunft zum Testen pharmakologischer Interventionen verwendet werden, die eine verletzungsbedingte axonale Degeneration in motorischen Schaltkreisen verlangsamen oder verhindern können.

Bei der Analyse der Aktivität absteigender und aufsteigender Neuronen im Brust-Hals-Konnektivum nach der Einnahme von Koffein beobachteten wir trotz zuvor berichteter Verhaltensänderungen keine großen Veränderungen der neuronalen Aktivität bei niedriger Koffeinkonzentration45. Andererseits beobachteten wir große Wellen neuronaler Aktivität nach der Einnahme einer hochkonzentrierten Koffeinlösung. Einige Fliegen hatten mehrere dieser Wellen, was darauf hindeutet, dass sie nicht auf die Kalziumfreisetzung im Rahmen eines Zelltodprozesses im Endstadium zurückzuführen sind. Der Ursprung dieser Kalziumdynamik bleibt jedoch unklar. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Koffein die zytoplasmatische Freisetzung interner Ca2+54-Speicher induziert. Obwohl dies im Fall der Einnahme von Koffein unwahrscheinlich sein mag, bleibt unklar, ob sich zeitlich ausbreitende Aktivitätswellen aus einem solchen Mechanismus oder einem tiefgreifenden neuronalen Feuern resultieren und könnte im Mittelpunkt künftiger Studien mit diesen Instrumenten stehen. Wir beobachteten insbesondere, dass sich die Tiere nach der Fütterung mit unserer hochkonzentrierten Koffeinlösung nicht erholten. Dennoch zeigt dieser Proof-of-Concept, wie die Langzeitbildgebung bei Drosophila in Zukunft genutzt werden kann, um die Auswirkungen der Medikamenteneinnahme auf die neuronale Dynamik bei sich verhaltenden Tieren zu untersuchen.

Basierend auf diesen erfolgreichen Fallstudien gehen wir davon aus, dass unsere mikrotechnischen Langzeitbildgebungsgeräte zur Untersuchung einer Vielzahl zusätzlicher Fragen und Herausforderungen eingesetzt werden können. Beispielsweise könnte man diese Geräte einsetzen, um das Fortschreiten des Zelltods in Drosophila-Modellen neuronaler Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit aufzuzeichnen55. Unsere Pipeline zur Implantatherstellung ist auch verallgemeinerbar. Daher könnten Implantatformen angepasst werden, um andere experimentelle Herausforderungen zu bewältigen, einschließlich der gezielten Ansteuerung von Schaltkreisen der Bauchganglien, die die Paarungsempfänglichkeit bei Weibchen regulieren56. Darüber hinaus könnten Implantate so modifiziert werden, dass sie aktive Komponenten speichern und freisetzen, die beispielsweise Verbindungen auf kontrollierte Weise in die Hämolymphe abgeben. Schließlich könnten zusätzliche Schritte unternommen werden, um die Implantation zu automatisieren, beispielsweise durch Öffnen der Thoraxkutikula mit einem UV-Excimer-Laser57 oder durch die Entwicklung robotergestützter Manipulationstechniken, um Brustorgane automatisch zu verschieben, das Implantat zu positionieren und das Thoraxloch mit einem Fenster zu verschließen58.

Zusammenfassend ermöglichen die in dieser Arbeit vorgestellten technologischen Entwicklungen eine Vielzahl von Experimenten an einzelnen Fliegen über einen weiten Zeitbereich und eröffnen ein Verständnis dafür, wie sich biologische Systeme – insbesondere prämotorische und motorische Schaltkreise – im Laufe des Alterns oder des Fortschreitens der Krankheit verändern Verletzungen, Lernerfahrungen oder soziale Erfahrungen, als Reaktion auf Veränderungen im inneren Zustand oder als Folge der Nahrungs- oder Drogeneinnahme. Diese Daten wiederum können die Entwicklung anpassungsfähigerer Steuerungen für künstliche Systeme anregen, die in der Lage sind, ihre Form und Funktion zu ändern, um sich ständig ändernden Fähigkeiten und Bedürfnissen gerecht zu werden.

Thoraxfenster (transparente Polymerscheiben) wurden mittels Photolithographie59 hergestellt. Alle Belichtungsschritte wurden auf einem Mask Aligner (MJB4, Süss MicroTec, Deutschland) unter Verwendung von i-line-Beleuchtung durchgeführt. Chrommasken wurden mit einem direkten Laserschreiber (VPG-200, Heidelberg Instruments, Deutschland) und einem automatischen Maskenprozessor (HMR900, HamaTech, Deutschland) hergestellt. Die Abmessungen mikrogefertigter Strukturen wurden mit einem optischen Mikroskop (DM8000 M, Leica Microsystems, Schweiz) oder einem mechanischen Oberflächenprofilierer (Dektak XT, Bruker Corporation, USA) gemessen. Das Protokoll begann mit der 7-minütigen Behandlung der Oberfläche eines 4-Zoll-Siliziumwafers mit einem Plasmastripper (PVA TePla 300, PVA AG, Deutschland) bei 500 W, um dessen Benetzbarkeit zu verringern. Eine wässrige Lösung von 20 % (Gew./Vol.) Dextran (MP Biomedicals, MW 60.000–90.000 g/mol) wurde bei 1000 U/min geschleudert (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, USA) und bei 150 °C gebacken 2 min, um eine 1 μm dicke wasserlösliche Opferschicht zu bilden. Diese Schicht ermöglicht das sanfte Lösen von Fenstern am Ende des Herstellungsprozesses (ergänzende Abbildung 1a-i). Ein negativer Fotolack (SU-8 3025, Kayaku Advanced Materials, USA) wurde direkt auf die Opferschicht aufgeschleudert und weich gebacken (ergänzende Abbildung 1a-ii). Bemerkenswert ist, dass SU-8 bei dieser Dicke eine Durchlässigkeit von mehr als 95 %60 aufweist (https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/07/KAM-SU-8-3000-Datasheet-7.10-final .pdf). Nach der Belichtung wurden die Fenster nachgebacken und ungehärteter Resist mit einem Entwickler (Propylenglycolmethyletheracetat (PGMEA, 1-Methoxy-2-propanolacetat), Sigma-Aldrich, Deutschland) entfernt (Ergänzende Abbildung 1a-iii) . Anschließend wurde der Wafer mit SU-8-Fenstern mithilfe eines automatisierten Verarbeitungssystems (ACS200 Gen3, Süss MicroTec, Deutschland) mit einer 20 μm dicken Schicht aus positivem Fotolack (AZ 40XT) beschichtet. Diese zusätzliche Polymerschicht dient während des Metallabscheidungsprozesses als physikalische Maske. Eine zweite Chrommaske wurde hergestellt, um mithilfe der Fotolithographie eindeutige Kennungen auf die Fenster zu mustern. Anschließend wurde der Wafer mittels physikalischer Gasphasenabscheidung (EVA 760, Alliance-Concept, Frankreich) mit Ti- und Au-Filmen61 in einer Dicke von 3 nm bzw. 15 nm beschichtet (ergänzende Abbildung 1a-iv). Durch die Entwicklung des negativen Fotolacks (Remover 1165, Kayaku Adv. Mat., USA) wurden alle Schichten oben auf den Fenstern entfernt, mit Ausnahme der Zahlen, die als Markierungen dienen. Schließlich wurden die beschrifteten Fenster durch Auflösen der Opferschicht in entionisiertem Wasser freigegeben (ergänzende Abbildung 1a-vi). Die Fenster wurden gefiltert, bei Raumtemperatur getrocknet und vor der Verwendung in Experimenten sterilisiert. Die resultierenden Fenster waren optisch transparent (ergänzende Abbildung 1b) und hatten die richtige Größe, um Thoraxöffnungen abzudichten (ergänzende Abbildung 1c).

Wir haben eine zweistufige Mikrofabrikationstechnik entwickelt, um den Durchsatz zu maximieren, Urformen vor übermäßiger Nutzung zu schützen und die Technologieverbreitung zu erleichtern62,63. Kurz gesagt: Implantate wurden in Elastomerschablonen gegossen, die aus einem geätzten Wafer hergestellt wurden, der als Urform diente. Zunächst wurde ein 4-Zoll-Siliziumtestwafer (100/P/SS/01-100, Siegert Wafer, Deutschland) mit Hexamethyldisilazan (HMDS) (CAS-Nummer: 999-97-3, Sigma-Aldrich, Deutschland) behandelt und dehydriert bei 125 °C, um die Haftung auf der Oberfläche zu verbessern. Anschließend wurde der Wafer mit einem 8 μm dicken Film aus positivem Fotolack (AZ 9260, Microchemicals GmbH, Deutschland) unter Verwendung eines automatischen Lackverarbeitungssystems (EVG 150, EV Group, Deutschland) schleuderbeschichtet (ergänzende Abbildung 3a-i). Nach den Back-, Belichtungs- und Entwicklungsschritten wurde der Wafer dann mithilfe von Deep Reactive Ion Etching (DRIE), insbesondere einem Bosch-Prozess,64 (AMS 200 SE, Alcatel) bearbeitet, um nahezu vertikale Wände mit einem hohen Seitenverhältnis zu erhalten (ergänzende Abbildung). 3a-ii). Der verbleibende positive Resist wurde in einem Entferner (Remover 1165, Kayaku Advanced Materials, USA) bei 70 ° C entfernt und durch Spülen mit Wasser und Lufttrocknung gereinigt (ergänzende Abbildung 3a-iii). Die Elastomerschablonen wurden durch Replikaformen unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt. Der Replika-Formprozess begann mit der Dampfabscheidung von Silan (Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl) Silan, Sigma-Aldrich, Deutschland) auf die Oberfläche der Masterform in einer Vakuumkammer für 6 Stunden. Die Silanisierung wurde nur einmal durchgeführt, da sie eine dauerhafte Silanschicht bildet. PDMS wurde als Mischung (10:1, Gew./Gew.) des Elastomers und des Härters (GMID-Nummer: 01673921, Dow Europe GmbH, Deutschland) hergestellt und in einer Petrischale auf den Wafer gegossen. Um alle in den Vertiefungen mit hohem Seitenverhältnis eingeschlossenen Blasen freizusetzen, wurde die Form mit einer Vakuumpumpe (EV-A01-7, Swiss Vacuum Technologies SA, Schweiz) in einem Vakuumexsikkator (F42020-0000, SP Bel-Art Labware & Apparatus) entgast , USA). Abschließend wurde das Elastomer 5 Stunden lang bei 65 ° C in einem Ofen (UF30, Memmert GmbH, Deutschland) ausgehärtet und die PDMS-Platte abgezogen (ergänzende Abbildung 3b). Unter Verwendung von Ausrichtungsmarkierungen als Orientierungshilfe wurde die Platte dann mit einer Rasierklinge in mehrere Stücke geschnitten, die als Schablonen dienten, mit denen dann Implantate hergestellt werden konnten (ergänzende Abbildung 3c).

Flexible Implantate wurden aus einem photohärtbaren Polymer (Ostemer 220, Mercene Labs AB, Schweden) hergestellt. Die Polymerisation erfolgt, wenn eine Mischung aus zwei Komponenten (Teil A und Teil B) UV-Licht ausgesetzt wird (ergänzende Abbildung 4a-i). Das PDMS-Templat wurde 1 Stunde lang in einem Vakuumexsikkator silanisiert (Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan, Sigma-Aldrich, Deutschland) (Ergänzende Abbildung 4a-ii). Teil A wurde über Nacht auf 48 °C erwärmt, um sicherzustellen, dass keine ungelösten Kristalle in der Lösung zurückblieben. Teil B und der Behälter wurden vor dem Mischen ebenfalls auf 48 °C erhitzt. Anschließend wurden die Teile A und B gründlich vermischt und die Mischung 5 Minuten lang in einer Vakuumkammer entgast. Ein 200-μl-Tropfen der Mischung (1,86:1, Gew./Gew.) wurde auf die Schablone gegossen (ergänzende Abbildung 4a-iv) und die Schablone wurde mit zwei Clips mechanisch zwischen zwei Glasobjektträgern eingeklemmt. Der Glasobjektträger, der das Implantatpolymer berührt, wurde zuvor 1 Minute lang bei 29 W mit Plasma behandelt (PDC-32G, Harrick Plasma, USA), um die Freisetzung des Implantats durch Verbesserung der Haftung zwischen Glas und Implantaten zu erleichtern. Die Lösung wurde zur Polymerisation 10 Minuten lang UV-Licht (365 nm, UV9W-21, Lightning Enterprises, USA) ausgesetzt (ergänzende Abbildung 4a – v). Die Proben wurden während der UV-Belichtung mehrmals gedreht, um eine homogene Reaktion im gesamten Templat sicherzustellen. Die Implantate wurden durch mechanisches Rühren der Schablonen in Isopropylalkohol (IPA) unter Verwendung eines Ultraschallgeräts (DT 100 H, Bandelin Sonorex Digitec, Deutschland) freigesetzt (ergänzende Abbildung 4a-vi). Dieser gesamte Prozess ergab einen Wafer mit 100 Implantaten (ergänzende Abbildung 4b, c), die anschließend vor der Implantation mit einer Rasierklinge ausgeschnitten wurden.

Wir haben einen Manipulatorarm entworfen und konstruiert, um Brustorgane während der Implantation vorübergehend zu verschieben (ergänzende Abbildung 5a, b). Um den Arm zu konstruieren, haben wir zunächst eine Form in 3D gedruckt, die es uns ermöglichte, einen Dissektionsstift (26002-10, Fine Science Tools, Deutschland) auf reproduzierbare Weise an die Spitze einer Spritzennadel (15391557, Fisher Scientific, USA) zu kleben ( Ergänzende Abbildung 5c). Der Stift wird in die Nadel eingeführt, bis seine Spitze das Ende der Form berührt. Wir haben den Stift mit einem UV-härtbaren Kleber (Bondic, Aurora, ON Kanada) an die Nadel geklebt. Anschließend wurde der Arm mit einer Pinzette gebogen und von einer zweiten 3D-gedruckten Form geführt (ergänzende Abbildung 5d). Der Stift wurde zunächst grob gebogen und dann mithilfe der 3D-gedruckten Form feiner angepasst. Anschließend wurde ein weiteres 3D-gedrucktes Teil verwendet, um die Spritzennadel mit einem 3-Achsen-Mikromanipulator (DT12XYZ, ThorLabs, USA) und einer Verlängerungsstufe zu verbinden (ergänzende Abbildung 5a). Die gesamte Struktur wurde dann an einem Steckbrett (MB1224, ThorLabs, USA) befestigt (ergänzende Abbildung 5b).

Wir verwendeten direktes Laserschreiben65, um einen maßgeschneiderten, nachgiebigen Mechanismus herzustellen, der Fliegen während der Zwei-Photonen-Mikroskopie an Ort und Stelle hält. Der Mechanismus wurde mit 3D-CAD-Software (SolidWorks 2021, Dassault Systémes, Frankreich) entworfen. Als Substrat, auf das Strukturen gedruckt wurden, wurde ein 25 mm × 25 mm großer gewürfelter Siliziumwafer verwendet. Die Oberfläche des Substrats wurde 7 Minuten lang bei 500 W plasmabehandelt und 15 Sekunden lang mit einer wässrigen Lösung von 10 % (Gew./Vol.) Poly(acrylsäure) (MW 50000, Polysciences, USA) bei 2000 U/min unter Verwendung einer Schleuderbeschichtung beschichtet -Beschichter (WS-650-23, Laurell Technologies Corporation, USA) (Ergänzende Abbildung 6a-i-iii). Der Mechanismus wurde unter Verwendung eines direkten Laserschreibers (Photonic Professional GT+, Nanoscribe GmbH, Deutschland) hergestellt, der die Zwei-Photonen-Polymerisation steuert (ergänzende Abbildung 6a-iv). Als Druckmaterial wurde ein Polymer (IP-S, Nanoscribe GmbH, Deutschland) aufgrund seines Young-Moduls von 4,6 GPa66 und der Auflösung, mit der Strukturen gedruckt werden konnten, ausgewählt. Das Gesamtdesign wurde in mehrere Bilder segmentiert, da der maximale Laserscanbereich, der von einem 25-fach-Objektiv (NA 0,8, Zeiss) bereitgestellt wird, 400 μm beträgt. Dieser Ansatz führt zu einem feinen Druck über ein relativ großes Layout. Das Objektiv wurde beim Drucken in flüssigen Fotolack getaucht. Am Ende des Druckvorgangs wurde das ungehärtete Polymer mit einem Entwickler (PGMEA, Sigma-Aldrich, Deutschland) 20 Minuten lang entfernt (Ergänzende Abbildung 6a – v). Abschließend wurde das PGMEA mit IPA gespült. Der Mechanismus wurde vom Substrat gelöst, indem die Opferschicht in entionisiertem Wasser aufgelöst wurde (ergänzende Abbildung 6a-vi). Dies ergab eine mikrogefertigte Struktur, die groß genug war, um den Brustkorb der Fliege aufzunehmen (ergänzende Abbildung 6b, c). Die Wiedermontage wurde abgeschlossen, indem der Mechanismus mit UV-härtbarem Kleber (Bondic, Aurora, Ontario, Kanada) an einem lasergeschnittenen Aluminiumrahmen befestigt wurde.

Die zur Herstellung unserer mikrotechnischen Geräte erforderlichen Materialien und Ausrüstungen sind in den Ergänzungstabellen 2 und 3 zusammengefasst.

Die Schritte, die erforderlich sind, um Fliegen auf die Langzeit-VNC-Bildgebung vorzubereiten, werden hier beschrieben (Abb. 1e, die inneren Organe wurden anhand von Daten aus Lit. 67 skizziert). Weitere Einzelheiten finden Sie im Zusatzfilm 2.

Eine Fliege wurde 5 Minuten lang kalt betäubt. Dann wurde es auf der Unterseite eines Präparationstischs positioniert und seine Flügel wurden mit einer Pinzette in der Nähe ihrer Basis entfernt. Der Brustkorb wurde dann durch ein Loch (Etchit, Buffalo, MN) in der Stahlunterlage der Bühne (McMaster-Carr, USA; 0,001 Zoll Edelstahl, Typ 316 weichgeglüht; Teilenummer 2317K11) gedrückt. Anschließend wurde die Bühne auf den Kopf gestellt und ein kleiner Tropfen UV-härtbarer Kleber (Bondic, Aurora, ON Kanada) wurde auf das Schildchen gegeben, um die Fliege an Ort und Stelle zu fixieren.

Die Bühne wurde mit Kochsalzlösung gefüllt (Ergänzungstabelle 1). Anschließend wurde mit einer 30-G-Spritzennadel ein kleines rechteckiges Loch (kleiner als das Fenster mit 600 μm Durchmesser) in die dorsale Brustkutikula geschnitten. Das Loch wurde hergestellt, indem die Nadel in den hinteren Brustkorb nahe dem Schildchen eingeführt wurde. Dann wurden drei Linien in den seitlichen und vorderen Brustkorb geschnitten. Eine letzte Linie wurde geschnitten, um eine rechteckige Öffnung zu vervollständigen. Das entstandene Stück Nagelhaut wurde dann mit einer Pinzette entfernt.

Restliche degradierte IFMs wurden mit einer Pinzette aus dem geöffneten Thorax entfernt. Dann wurde eine gezogene Glasnadel (P-1000, Sutter Instrument, USA) (30-0018, Harvard Apparatus, USA) verwendet, um kleine Luftröhrenverbindungen zwischen einem großen Stück Luftröhre und der linken Seite des Darms zu lösen. Anschließend wurde auch die linke Speicheldrüse mit einer Pinzette entfernt.

Der Manipulatorarm wurde mit sichtbarer Spitze oben auf der Bühne positioniert. Der Präparationstisch wurde so positioniert, dass der Kopf der Fliege zum Experimentator zeigte. Anschließend wurde die Armspitze mit einem 3-Achsen-Manipulator (DT12XYZ, ThorLabs, USA) in den Thorax eingeführt. Die Spitze des Arms wurde dann in die rechte Seite des Darms (des Experimentators) nahe der Mitte des Proventriculus eingeführt. Die Spitze wurde tief genug eingeführt, um unter dem Kropf und den Speicheldrüsen zu liegen, aber den VNC nicht zu berühren. Sobald sich die Armspitze auf der rechten Seite der Speicheldrüse, Kropf und Darm befand, wurde sie zur linken Seite der Brusthöhle gezogen, um Platz für das geschlossene Implantat zu schaffen.

Sobald die Organe der Fliegen durch den Manipulationsarm sicher auf der linken Seite der Brusthöhle gehalten wurden, wurde das Implantat mit einer Pinzette in der Luft verschlossen und dann in die Kochsalzlösung überführt, die den Präparationsschritt füllte. Anschließend wurde das geschlossene Implantat vor der Fliege auf dem Tisch positioniert. Als nächstes wurde eine dünnere Pinzette verwendet, um das Implantat in den Brustkorb des Tieres einzuführen. Abschließend wurde eine Glasnadel verwendet, um die Position des Implantats anzupassen und es auf der richtigen Höhe zu halten, sodass es sich passiv öffnen konnte. Sobald der Arm entfernt war, wurde mit der Glasnadel die linke Seite des Implantats vorsichtig in Richtung der Unterseite des Brustkorbs gedrückt und alle Blasen auf dem Implantat entfernt.

Sobald das Implantat gut positioniert war, wurde eine Spritzennadel (15391557, Fisher Scientific, USA) verwendet, um die Kochsalzlösung vom Objekttisch zu entfernen. Anschließend wurde ein Fenster über dem Cuticula-Loch positioniert und mit der Identifikationsnummer auf der Rückseite des Brustkorbs in der Nähe des Scutellums zentriert. Anschließend wurden mit einem Draht winzige Tropfen UV-härtbaren Klebers zwischen dem Fenster und der umgebenden Brustkutikula angebracht, beginnend auf der rechten Seite des Schildchens und endend auf der linken Seite. Dann wurde die Kochsalzlösung wieder in die Bühne gegeben. Der ausgehärtete UV-Kleber, der die Fliege zuvor an der Bühne befestigt hatte, wurde mit einer Nadel entfernt. Anschließend wurde auch die Salzlösung entfernt und das Fenster vollständig versiegelt, indem UV-Kleber auf die hintere Nagelhaut der Fliege in der Nähe des Schildchens aufgetragen und ausgehärtet wurde.

Sobald das Brustloch vollständig durch ein transparentes Fenster verschlossen war, wurde die Fliege aus der Sektionsphase abmontiert, indem die Vorderseite des Brustkorbs vorsichtig durch das Loch in der Stahlscheibe gedrückt wurde. Anschließend wurde die Fliege in ein Fläschchen mit Futter zurückgesetzt, um sich zu erholen.

Alle Fliegen wurden mit Standard-Maismehlfutter in einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus aufgezogen. Die Experimente für jede einzelne Studie wurden zu einer einheitlichen Tageszeit durchgeführt, um die Möglichkeit zirkadianer Störfaktoren auszuschließen. Für Drosophila-Experimente war keine besondere ethische Genehmigung erforderlich. Für die meisten Experimente wurden weibliche Fliegen verwendet, da diese größer sind. Dies erleichtert die Dissektion, Implantation und Anbindung. Es erleichtert auch die rechnerische Bildverarbeitung und die Erkennung neuronaler interessierender Bereiche.

Weibliche Fliegen, die CsChrimson in absteigenden Moonwalker-Neuronen (MDNs)28 exprimieren (UAS-CsChrimson/Act88F-Rpr; VT50660.p65AD(attp40)/+; VT44845.Gal4DBD(attp2)/+) (Abb. 2), wurden nach fünf Tagen implantiert. Post-Eklosion (dpe). Für dieses Experiment wurden die Implantate vor der Implantation mechanisch verschlossen in eine 30 mg/ml Dextranlösung (#31392, Sigma-Aldrich, Schweiz) getaucht. Anschließend wurden die Implantate aus der Lösung genommen und mit einem gedrehten Kimwipe (5511, Kimberly-Clark, USA) getrocknet. Dieser Schritt wurde durchgeführt, um Implantate in einer geschlossenen Position zu fixieren. Später stellten wir jedoch fest, dass Dextran zum Schließen von Implantaten nicht erforderlich ist, und haben diesen Schritt gestrichen. Anschließend wurden die Implantate wie oben beschrieben im Brustkorb der Fliege positioniert. Die Anzahl der Tage nach der Implantation wird als „Tage nach der Implantation“ (dpi) bezeichnet. Kontrolltiere gleichen Alters und Geschlechts wurden aus derselben Elternkreuzung ausgewählt. Für Langlebigkeitsstudien wurden die Fliegen einzeln in Futterfläschchen gehalten und alle 1–2 Tage untersucht.

Studien zur Fortbewegung wurden bei 1–3 dpi, 14–16 dpi und 28–30 dpi durchgeführt. Die Tiere wurden einzeln kalt betäubt und dann zur optogenetischen Aktivierung und Videoaufzeichnung in abgerundete quadratische Arenen überführt. Jede Aufzeichnung bestand aus 30 Sekunden lang spontan erzeugten Verhaltensweisen (hauptsächlich Gehen und Fellpflege), gefolgt von drei 3-sekündigen Perioden optogenetischer Stimulation bei 590 nm (6 mW/cm2) mit 10-sekündigen Interstimulusintervallen. Daher dauerte jede Aufnahmesitzung 59 Sekunden.

Um Videodaten zu verarbeiten, wurden die Schwerpunkte der Fliegen mit einer angepassten Version von Tracktor68 verfolgt. Ihre Orientierungen wurden dann mithilfe eines neuronalen Netzwerks (implementiert in PyTorch69) extrahiert, das anhand handbeschrifteter Daten trainiert wurde. Das Netzwerk bestand aus zwei Faltungsschichten, gefolgt von drei vollständig verbundenen Schichten. Auf alle Ebenen, mit Ausnahme der letzten, folgte eine ReLU-Aktivierungsfunktion70. Wir haben auch einen Dropout nach den ersten beiden vollständig verbundenen Schichten mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,2 angewendet71. Um das Netzwerk zu trainieren, haben wir insgesamt 300 Proben in drei Ausrichtungen (Kopf nach oben, Kopf nach unten und seitwärts) handkommentiert. Die Graustufenbilder wurden dann mithilfe der Tracktor-Schwerpunktpositionen zugeschnitten und auf 32 × 32 Pixel verkleinert. Während des Trainings haben wir zufällig affine Transformationen (20 Grad Drehung, 5 Pixel Translation und Skalierungsfaktor 0,2) sowie horizontale und vertikale Flip-Augmentationen mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,5 angewendet. Für die gesamte Datenerweiterung haben wir das Torchvision-Paket von PyTorch verwendet. Das Netzwerk wurde mit Kreuzentropieverlust unter Verwendung von 80 % der Daten trainiert. Wir haben einen Adam-Optimierer mit einer Lernrate von 0,001 verwendet, ohne Gewichtsabnahme und Lernratenabfall72. Wir haben für 1000 Epochen trainiert und die Gewichte mit dem besten Testfehler ausgewählt.

Translationsgeschwindigkeiten wurden durch Anwendung eines Savitzky-Golay-Filters zweiter Ordnung mit einer Ableitung erster Ordnung auf Schwerpunktpositionen berechnet. Für Bewegungen entgegen der Bewegungsrichtung des Tieres wurde das Vorzeichen für die Geschwindigkeitswerte auf negativ gesetzt. Fliegen, die während des Stimulationszeitraums länger als 0,3 s mit den Wänden der Arena kollidierten, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Fliegen, die während des Stimulationszeitraums nach hinten gedreht wurden (dh auf der mit Sigma beschichteten Decke liefen), wurden ebenfalls von der Analyse ausgeschlossen. Die Metrik „Rückwärtsgang-Reaktionssteigung“ wurde als Beschleunigung vom Beginn jeder Stimulationsperiode bis zur in dieser Periode erreichten Mindestgeschwindigkeit (maximale Rückwärtsgeschwindigkeit) berechnet. Die Metrik „Zurückgelegte Gehstrecke“ wurde als linke Riemann-Summe der Geschwindigkeitskurven während jeder Stimulationsperiode berechnet. Wir haben nur Frames berücksichtigt, bei denen die Geschwindigkeit negativ war. Schließlich ist die „maximale negative Translationsgeschwindigkeit“ der minimale Geschwindigkeitswert, der in jeder Stimulationsperiode erreicht wird.

Für Studien zum männlichen Überleben und Verhalten wurden Tiere, die Reaper in ihren indirekten Flugmuskeln exprimierten (Act88F-Rpr; UAS-GFP; +/+), einen Tag nach der Eklosion (dpe) implantiert. Kontrolltiere mit gleichem Alter und Geschlecht („Intakt“) wurden aus derselben Elternkreuzung ausgewählt. Die Fliegen wurden einzeln in Futterfläschchen untergebracht und jeden Tag in ein neues Futterfläschchen umgedreht, während ihre Langlebigkeit beurteilt wurde (ergänzende Abbildung 10). Spontanes Verhalten wurde für drei Männer pro Gruppe aufgezeichnet. Diese Männchen wurden einzeln kalt betäubt und dann für Videoaufnahmen in abgerundete quadratische Arenen überführt. Jede Aufnahme besteht aus 60 Sekunden spontan erzeugter Verhaltensweisen.

Weibliche Fliegen, die GFP im gesamten Nervensystem exprimieren (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Abb. 1h), wurden bei 4–6 dpe implantiert und einzeln in Lebensmittelfläschchen gehalten. Bei 1–3 dpi, 14–16 dpi und 28–30 dpi wurden die Fliegen auf einem Wiedermontagetisch angebunden und 25 Bildvolumina mit einer Tiefe von 100 μm (Schrittweite von 1 μm) wurden unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops (Bergamo-II-Mikroskop, ThorLabs, USA) und einem 930-nm-Laser (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, USA) mit 20 mW Leistung am Probenort. Mit einem Galvo-Resonanz-Scanner23 haben wir 0,1 Volumina pro Sekunde (vps) erfasst. Die 25 Bilder pro Tiefe wurden dann mithilfe des HyperStackReg-Moduls in Fiji73 und einer Starrkörpertransformation zueinander registriert. Diese registrierten Bilder wurden anschließend entlang der Zeitachse in ein Standardabweichungsbild projiziert. Das resultierende Volumen wurde dann mit dem Temporal-Color-Makro von Fiji in der Tiefe farbcodiert.

Für Experimente mit männlichen Fliegen haben wir Tiere abgebildet, die GFP im gesamten Nervensystem exprimieren (Act88F-Rpr; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Ergänzende Abbildung 10). Diese Tiere wurden bei 1 dpe implantiert und einzeln in Futterfläschchen gehalten. Bei 1 dpi, 5 dpi und 10 dpi wurden Fliegen angebunden und eine volumetrische Aufzeichnung des VNC wurde unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops bei 930 nm mit 11 mW Laserleistung durchgeführt. Die Fliegen wurden unter Verwendung von ventral appliziertem Kohlendioxid (1,3 l/min) anästhesiert, während das Bildvolumen aufgezeichnet wurde. Die Volumina bestanden aus 512 × 512 Pixel-Frames, die alle 1 μm über eine Gesamttiefe von 100 μm aufgenommen wurden. Anschließend wurden Z-Projektionen mit Tiefenfarbcodierung mithilfe des Fidschi-Makros „Temporal-Color“ erstellt.

Fliegen, die GCaMP6f und tdTomato im gesamten Nervensystem exprimieren (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+), wurden bei 5 dpe (weiblich) oder 1 dpe (männlich) implantiert und dann auf dem montiert Zwei-Photonen-Bildgebungsstufe mit 1, 5 und 10 dpi (weiblich, Zusatzfilm 4; männlich, Zusatzfilm 5). Eine horizontale Bildebene des prothorakalen Neuromers wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop bei 930 nm und 25 mW Leistung aufgenommen. Drei horizontale Z-Ebenen-Bilder wurden mit einem Galvo-Resonanz-Scanner aufgenommen und mit einer Bildrate von 10,7 fps zu einem Bild gemittelt. Verhaltensbilder wurden gleichzeitig (wie in Lit. 23) mit einer Rate von 80 fps erfasst.

Eine weibliche Fliege, die GCaMP6f und tdTomato in absteigenden DNa01-Neuronen23,48 (Act88F-Rpr/+; GMR22C05-AD-spGal4/UAS-GCaMP6f; GMR56G08-DBD-spGal4 / UAS-tdTomato) exprimiert, wurde bei 3 dpe implantiert. Die gleiche Fliege wurde dann mit 1, 3 und 5 dpi auf dem Zwei-Photonen-Mikroskoptisch montiert. Eine horizontale Bildebene des prothorakalen Neuromers wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop bei 930 nm und einer Laserleistung von 28 mW erfasst. Horizontalebene Bilder wurden mit einem Galvo-Galvo-Scanner mit einer Bildrate von 5,6 fps aufgenommen. Verhaltensbilder wurden gleichzeitig (wie in Lit. 23) mit einer Rate von 80 fps erfasst. AxoID wurde verwendet, um die Neuronen als Regionen von Interesse (ROIs) in Zwei-Photonen-Mikroskopbildern zu erkennen und ihre Fluoreszenzwerte zu extrahieren50. Der in Lit. beschriebene halbautomatische Klassifikator für neuronale Fluoreszenzereignisse. 50 wurde verwendet, um neuronale Aktivitätsereignisse anhand von Fluoreszenzspuren zu erkennen. Diese wurden dann mit sphärischen Laufbandrotationen korreliert.

Um zu veranschaulichen, wie andere Implantatdesigns verwendet werden könnten, um optischen Zugang zu hinteren Regionen des VNC zu erhalten (ergänzende Abbildung 9), exprimierte eine weibliche Fliege GFP im gesamten Nervensystem (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) wurde bei 3 dpe präpariert. Ein Tropfen UV-Kleber wurde auf die Spitze eines Implantats ausgehärtet. Auch die Implantation wurde leicht modifiziert: Nach dem Einsetzen in den Brustkorb der Fliege wurde das Implantat nach hinten gedrückt, wobei der ausgehärtete Kleber an der inneren Kutikula des Scutellums anliegt und das Implantat in seiner Position fixiert. Anschließend wurde die Fliege mit einem transparenten Fenster verschlossen. Ein Abbildungsvolumen (576 × 576 Pixel und 100 μm tief) des VNC wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Galvo-Galvo-Scanner bei 930 nm und 22 mW Laserleistung aufgezeichnet.

Weibliche Fliegen, die GFP in ihren Chordotonalorganen exprimieren (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) (Abb. 3), wurden bei 1 dpe implantiert. Ein Z-Stapel des VNC wurde mit 1 dpi unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops bei 930 nm und 55 mW Laserleistung aufgezeichnet. Die Fliegen wurden mit Kohlendioxid (1,8 l/min) betäubt, das ventral zugeführt wurde, während Z-Stapel aufgezeichnet wurden. Z-Stapel bestanden aus 576 × 384 Pixel-Frames, die alle 1 μm über eine Gesamttiefe von 100 μm aufgenommen wurden (dh 100 Frames pro Volumen). Anschließend wurde das vordere linke Bein am Thorax-Coxa-Gelenk mit einer Präparierschere (#15300-00, Fine Science Tools, Deutschland) entfernt. Anschließend wurde sofort ein zweiter Z-Stapel aufgenommen. Die Fliegen wurden einzeln in Futterfläschchen gehalten und jeden Tag mit den gleichen Aufnahmeparametern bis 15 dpi fotografiert. Die lineare Stapelausrichtung von Fidschi mit dem SIFT-Registrierungs-Plugin74 wurde dann verwendet, um alle projizierten Z-Stacks beim ersten Z-Stack zu registrieren. Anschließend wurde ein benutzerdefiniertes Python-Skript verwendet, um die mittlere Fluoreszenz bestimmter interessierender Regionen zu zeichnen und zu extrahieren. Die mittlere Fluoreszenz innerhalb dieser Regionen wurde für jeden Tag gemessen und über die Tiere hinweg normalisiert, indem sie durch die mittlere Fluoreszenz am ersten Tag dividiert wurde.

Das Nervensystem der Fliegen wurde präpariert und mit Paraformaldehyd (441244, Sigma-Aldrich, USA) bei 20 dpi fixiert. Die Proben wurden gegen nc82 mit primärem Maus-Anti-nc82-Antikörper gefärbt, der im Verhältnis 1:20 in PBST-Lösung verdünnt wurde, und anschließend mit konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Alexa 633-sekundären Antikörper im Verhältnis 1:500 verdünnt (detailliertes Verfahren in Lit. 23 beschrieben). Dadurch konnten wir konfokale Bilder aufnehmen, die sowohl Neuropil-Markierungen als auch die endogene GFP-Expression enthielten. Zur Aufnahme konfokaler Bilder wurde die Software Zen 2011 14.0 verwendet. Konfokale Laserintensitäten und PMT-Verstärkungen wurden manuell ausgewählt, um eine Pixelsättigung zu vermeiden. Diese konfokalen Z-Stapel wurden dann unter Verwendung der Fidschi-Standardabweichungsprojektion in 2D projiziert. Die Standardabweichungsprojektion der GFP-Expression wird als invertiertes Bild dargestellt (Abb. 3c, d). Ein benutzerdefiniertes Python-Skript wurde geschrieben, um die Grenzen des VNC mithilfe der Standardabweichungsprojektion von NC82-Bildern zu erkennen. Diese Kontur wurde mithilfe der Open CV-Bibliothek erkannt und dann auf GFP-Standardabweichungsprojektionsbildern gezeichnet.

Weibliche Fliegen (5 dpe), die im gesamten Nervensystem einen Kalziumindikator, GCaMP6f, und einen anatomischen Marker, tdTomato, exprimieren (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) (Abb. 4) wurden 21–23 Stunden lang auf einem feuchten Kimwipe (5511, Kimberly-Clark, USA) ausgehungert. Anschließend wurden sie ohne Thoraxfenster implantiert und im Dissektionsstadium belassen (das Remontagestadium wurde hier nicht verwendet), um die Anzahl der Eingriffe zu begrenzen. Die Tiere wurden dann unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop positioniert, wo sie auf einem kugelförmigen Laufband laufen konnten, das aus einem luftunterstützten (0,8 l/min) Schaumstoffball (Last-A-Foam FR7106, General Plastics, USA) mit einem Durchmesser von 1,5 mm bestand cm23. Anschließend wurden koronale Querschnitte ihres Halsbindegewebes bei 930 nm mit einer Laserleistung von 15 mW abgebildet. Mithilfe eines Galvo-Resonanz-Scanners erreichten wir eine Bildrate von 16 Bildern pro Sekunde (fps). Parallel dazu wurde das Verhalten der Fliegen mit sieben Kameras mit 80 fps aufgezeichnet. Mit zwei optischen Strömungssensoren wurden auch Kugelrotationen entlang dreier Achsen gemessen6,23. Wir haben die neuronale Aktivität und das neuronale Verhalten in Versuchen von jeweils ca. 4 Minuten Dauer aufgezeichnet. Zunächst wurden vier Versuche aufgezeichnet. Dann wurde der Schaumstoffball abgesenkt und die Aufzeichnung fortgesetzt, während die Fliegen mit einer Lösung gefüttert wurden, die entweder aus (i) 1 ml entionisiertem Wasser, 8 mg Saccharose (A2188.1000, Axon Lab, Schweiz) und 1 mg Amaranth-Farbstoff (A1016, Sigma-Aldrich, USA), (ii) eine Koffeinlösung mit niedriger Konzentration, bestehend aus 1 ml entionisiertem Wasser, 8 mg Koffein (C0750, Sigma-Aldrich, USA), 8 mg Saccharose und 1 mg Amaranth, oder (iii) eine hohe Koffeinlösung Konzentration übersättigter Koffeinlösung bestehend aus 1 ml entionisiertem Wasser, 40 mg Koffein, 8 mg Saccharose und 1 mg Amaranth. Die Tiere wurden mit einer gezogenen Glasnadel (P-1000, Sutter-Instrument, USA; Puller-Parameter – Hitze: 502; Zug: 30; Geschwindigkeit: 120; Zeit: 200; Druck: 200) gefüttert. Ein kleiner Tropfen UV-härtbarer Kleber (Bondic, Aurora, ON, Kanada) wurde nahe der Nadelspitze hinzugefügt, um zu verhindern, dass die Lösung auf der Nadel nach oben wandert. Die Nadel wurde mit einem Manipulator (uMp-3, Sensapex, Finnland) vor den Fliegen positioniert. Nach der Fütterung wurde das kugelförmige Laufband unter der Fliege neu positioniert und es wurden acht weitere bildgebende Versuche durchgeführt.

Sofern nicht anders angegeben, haben wir benutzerdefinierten Python-Code verwendet. Bei allen Bildanalysen verläuft die y-Achse ventral-dorsal entlang des Fliegenkörpers und die x-Achse verläuft medial-lateral. Bild- und Filterkerngrößen werden als (y, x) in Pixeleinheiten angegeben. Aufnahmen aus dem Brust-Hals-Konnektivum weisen große Inter-Frame-Bewegungen einschließlich großer Translationen sowie kleinere, nicht-affine Deformationen auf. Da Kalziumindikatoren (z. B. GCaMP6f) so konzipiert sind, dass sie eine niedrige Grundlinienfluoreszenz aufweisen, sind ihre Verwendung zur Bewegungskorrektur schwierig. Daher haben wir uns auf Signale des coexprimierten rot fluoreszierenden Proteins tdTomato verlassen, um sowohl die roten (tdTomato) als auch die grünen (GCaMP6f) PMT-Kanalbilder zu registrieren. Zuerst führten wir eine Schwerpunktregistrierung (COM) jedes aufgezeichneten Frames durch, um große Verschiebungen zu entfernen, und beschnitten die Hintergrundbereiche um das Halsbindemittel (von 480 × 736 auf 352 × 576). Anschließend haben wir mithilfe des optischen Flusses das Bewegungsfeld jedes roten Frames relativ zum ersten aufgezeichneten Frame berechnet und die Bewegung sowohl des roten als auch des grünen Frames mithilfe bilinearer Interpolation korrigiert. Der Algorithmus zur Korrektur der optischen Flussbewegung wurde zuvor in Lit. beschrieben. 23. Wir haben nur die optische Flusskomponente zur Berechnung der Bewegungsfelder verwendet und die Merkmalsanpassungsbeschränkung weggelassen. Wir haben den Gradienten des Bewegungsfelds reguliert, um die Glätte zu fördern (λ = 800). Python-Code für das Paket „Optic Flow Motion Correction“ (ofco) finden Sie unter https://github.com/NeLy-EPFL/ofco.

Wir beobachteten, dass die absoluten Fluoreszenzwerte auf der rechten Seite des Bindegewebes etwas niedriger waren als auf der linken Seite, was wahrscheinlich auf Streuung durch Brustorgane zurückzuführen ist, die durch das Implantat nach rechts gedrückt werden. Um diese ungleichmäßige absolute Fluoreszenz zu korrigieren, haben wir den Mittelwert aller bewegungskorrigierten Bilder über die Zeit berechnet. Anschließend haben wir das resultierende Bild einer Medianfilterung und einer Tiefpassfilterung unterzogen (Medianfilter: (71,91), Gaußfilter: σ = 3), um die Merkmale einzelner Neuronen zu entfernen und nur globale, räumliche Änderungen der Fluoreszenz beizubehalten. Anschließend haben wir den Mittelwert über die y-Achse berechnet, um ein Fluoreszenzprofil auf der x-Achse (links – rechts) zu erhalten und eine gerade Linie an die zentralsten 200 Pixel anzupassen. Um die Abnahme der Fluoreszenz zur rechten Seite hin zu korrigieren, haben wir die Fluoreszenz mit dem Kehrwert dieser geraden Linienanpassung an das x-Achsenprofil multipliziert. Beachten Sie, dass diese Korrektur nur bei der Visualisierung der Fluoreszenz hilft und keinen Einfluss auf die Berechnung von ΔF/F hat, da für ein bestimmtes Pixel sowohl die Fluoreszenz zu jedem Zeitpunkt als auch seine Basisfluoreszenz mit derselben Konstante multipliziert werden Faktor.

Um registrierte und korrigierte Daten zu entrauschen, verwendeten wir eine angepasste Version des DeepInterpolation-Algorithmus75. Kurz gesagt nutzt DeepInterpolation ein neuronales Netzwerk, um ein Mikroskopbild zu entrauschen, indem es aus zeitlich benachbarten Bildern „interpoliert“ wird. Ein U-Net wird unbeaufsichtigt trainiert, wobei 30 Frames (ca. 2 s) vor und 30 Frames nach dem Zielframe als Eingabe und dem aktuellen Frame als Ausgabe verwendet werden. Dadurch wird unabhängiges Rauschen aus dem Bild entfernt und Komponenten, die sich im Laufe der Zeit dynamisch entwickeln, bleiben erhalten. Wir haben das Trainingsverfahren so geändert, dass ein Stapel in den 11 GB RAM einer Nvidia GTX 2080TI-Grafikkarte passt: Anstatt den gesamten Frame (352 × 576 Pixel) zu verwenden, haben wir während des Trainings eine Teilmenge des Bildes (352 × 288 Pixel) verwendet. Wir haben die x-Koordinate der Teilmenge zufällig ausgewählt. Bei der Schlussfolgerung haben wir das gesamte Bild verwendet. Wir haben überprüft, dass die Verwendung unterschiedlicher Bildgrößen während des Trainings und der Inferenz das resultierende entrauschte Bild außerhalb der Grenzregionen nicht verändert. Wir haben für jede Fliege ein Modell mit 2000 zufällig ausgewählten Frames aus einem der Versuche vor dem Füttern trainiert und es auf alle nachfolgenden Frames angewendet. Die Trainingsparameter sind in Tabelle 1 aufgeführt. Der angepasste DeepInterpolation-Algorithmus ist im Zweig „adapttoR57C10“ des folgenden GitHub-Repositorys zu finden: https://github.com/NeLy-EPFL/deepinterpolation

Wir zeigen Fluoreszenzwerte als ΔF/F (Zusatzfilme 10–12). Dies wurde als \({{\Delta }}F/F=\frac{F-{F}_{0}}{{F}_{0}}\) berechnet, wobei F die zeitveränderliche Fluoreszenz und F0 ist ist die pixelweise Fluoreszenzbasislinie. Um F0 zu berechnen, haben wir einen räumlichen Gaußschen Filter (σ = 10) auf Bilder angewendet und jedes Pixel mit einem zeitlichen Fenster von 10 Abtastwerten (ca. 0,6 s) gefaltet. Anschließend haben wir die minimale Fluoreszenz jedes Pixels in allen Versuchen ermittelt.

Zur Messung sphärischer Laufbanddrehungen wurden optische Strömungssensoren verwendet6,23, diese sind jedoch von Natur aus verrauscht. Daher haben wir den gleitenden Durchschnitt über 80 Stichproben (ca. 200 ms) berechnet. Aus vorverarbeiteten Sensorwerten haben wir die Vorwärts-, Seitwärts- und Drehgeschwindigkeiten berechnet6. Wir klassifizierten stationäre Perioden (keine Bewegungen des Balls) als Perioden, in denen die absoluten optischen Flusswerte der sphärischen Laufbandrotationsgeschwindigkeiten unter einem Schwellenwert von \(0,31 {{{{{{{{\rm{ms}}}}}} lagen. }}}^{-1}\widehat{=}0,01\) Umdrehungen/s und mindestens 75 % der Frames innerhalb der Zeit ± 0,5 s der Stichprobe lagen unter diesem Schwellenwert. Das letztgenannte Kriterium stellte sicher, dass kurze Ruhephasen zwischen den Geheinheiten ausgeschlossen wurden.

Wir haben drei verschiedene Datenmodalitäten mit drei verschiedenen Abtastfrequenzen aufgezeichnet: Zwei-Photonen-Bildgebungsdaten wurden bei ~16 Hz aufgezeichnet, Verhaltensbilder von sieben Kameras wurden bei 80 Hz erfasst und Ballbewegungen mit zwei optischen Flusssensoren wurden bei fast 400 Hz gemessen. Um diese Messungen für die weitere Analyse zu synchronisieren, haben wir daher alle Messungen auf die Bildrate der Zwei-Photonen-Bildgebung heruntergerechnet, indem wir alle während eines Zwei-Photonen-Bildes erfassten Verhaltens- und Ballrotationsproben gemittelt haben.

Um normalisierte Fluoreszenzspuren für jeden Versuch zu berechnen – wie in Abb. 4e gezeigt – haben wir die Fluoreszenz über das gesamte Halsbindegewebe gemittelt und das 99 %-Perzentil dieser Zeitreihe während der Versuche vor der Fütterung berechnet. Anschließend normalisierten wir die Zeitreihen aller von dieser Fliege aufgezeichneten Versuche auf das 99-Prozent-Perzentil vor der Fütterung. Um eine statistische Analyse durchzuführen, verwendeten wir normalisierte Fluoreszenz und berechneten das Maximum (obere Grenze des 99 %-Perzentils) innerhalb bestimmter Zeiträume vor, während und nach der Fütterung. Vor dem Füttern beträgt die maximale normalisierte Fluoreszenz für jede der 9 Fliegen Eins, wie aus der Perzentilnormalisierung zu erwarten ist. Für Zeiträume <9 Minuten nach, <19 Minuten nach, <29 Minuten nach und <38 Minuten nach der Fütterung führten wir Mann-Whitney-U-Tests durch, um festzustellen, ob sich die maximale neuronale Aktivität nach hoher Koffeinaufnahme signifikant vom Maximum unterschied Aktivität nach Saccharose oder geringer Koffeinaufnahme (Abb. 4g). Mit dem Ziel, den geringsten Aufwand oder die erforderliche Vorverarbeitung anzuwenden, haben wir bis zu diesem Zeitpunkt Fluoreszenzdaten verwendet, die nicht mithilfe von DeepInterpolation entrauscht wurden. Um jedoch das genaue Timing der Wellen zu analysieren, haben wir in diesem Fall DeepInterpolation wie oben beschrieben angewendet. Dadurch werden Hintergrundfluoreszenz und Hochfrequenzrauschen reduziert. Um den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzwellen zu analysieren, haben wir zunächst den Zeitpunkt der Spitzenfluoreszenz über den gesamten Tpeak des zervikalen Bindegewebes ermittelt. Alle Zeiten werden relativ zum Zeitpunkt dieses Peaks angegeben, was eine Analyse präziser Zeitunterschiede ermöglicht. Anschließend haben wir die mittlere Fluoreszenz über die Zeit in manuell ausgewählten interessierenden Regionen (dorsale, laterale und ventrale Bindegewebsneuronen sowie Riesenfaserneuronen) berechnet und sie auf ihre Minimal- und Maximalwerte normalisiert dargestellt. Wir haben die Zeitreihe mit einem Gauß-Filter (\(\sigma=3\widehat{=}0,18\) s) geglättet. Um die Spitzenzeit für jedes Pixel zu ermitteln, haben wir einen zeitlichen Gaußschen Filter (\(\sigma=10\widehat{=}0,62\) s) und einen räumlichen Gaußschen Filter (σ = 1) angewendet und nach dem maximalen Fluoreszenzwert innerhalb von Tpeak gesucht ± 10 s. In Abb. 4f zeigen wir die mittlere Fluoreszenz während Zeiträumen, in denen die Fliege stationär war (dh den Ball nicht bewegte).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Rohdaten wurden in einem öffentlichen Repository abgelegt, das unter https://dataverse.harvard.edu/dataverse/long_term_imaging_vnc_drosophila verfügbar ist. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Maßgeschneiderte Codes zur Analyse der Rohdaten sind verfügbar unter: https://github.com/NeLy-EPFL/Long-Term-Imaging-VNC-Drosophilahttps://doi.org/10.5281/zenodo.6826488.

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Wir danken Alain Herzog für Fotos und Videos implantierter Tiere. LH dankt für die Unterstützung durch ein EU-H2020-Marie-Skłodowska-Curie-Stipendium (754354). JB dankt für die Unterstützung durch ein Doktorandenstipendium des Boehringer Ingelheim Fonds. VLR dankt dem mexikanischen Nationalrat für Wissenschaft und Technologie, CONACYT, für die Unterstützung unter der Fördernummer 709993. SG dankt für die Unterstützung durch ein EPFL SV iPhD-Stipendium. FA dankt für die Unterstützung durch ein Doktorandenstipendium des Boehringer Ingelheim Fonds. MSS dankt dem Europäischen Forschungsrat (ERC) für die Unterstützung im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Finanzhilfevereinbarung Nr. 714609). PR dankt für die Unterstützung durch ein SNSF-Projektstipendium (175667) und ein SNSF-Eccellenza-Stipendium (181239).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Laura Hermans, Murat Kaynak.

Neuroengineering Laboratory, Brain Mind Institute & Institute of Bioengineering, EPFL, Lausanne, Schweiz

Laura Hermans, Jonas Braun, Victor Lobato Rios, Chin-Lin Chen, Adam Friedberg, Semih Günel, Florian Aymanns & Pavan Ramdya

Labor für mikrobiorobotische Systeme, Institut für Maschinenbau und Institut für Bioingenieurwesen, EPFL, Lausanne, Schweiz

Laura Hermans, Murat Kaynak und Mahmut Selman Sakar

Computer Vision Laboratory, EPFL, Lausanne, Schweiz

Semih Günel

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LH – Konzeptualisierung, Methodik, Software, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Datenerfassung, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. MK – Methodik, Software, Validierung, formale Analyse, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. JB – Methodik, Software, formale Analyse, Datenkuration, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Visualisierung. VLR – Methodik, Software, formale Analyse, Datenkuration, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. C.-LC – Datenerfassung, Datenkuration, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten AF – Methodik, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten SG – Methodik, Software, Datenkuration, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. FA – Methodik, Software, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. MSS – Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Überwachung, Projektverwaltung, Finanzierungsbeschaffung. PR – Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Überwachung, Projektverwaltung, Finanzierungsbeschaffung.

Korrespondenz mit Mahmut Selman Sakar oder Pavan Ramdya.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Davide Raccuglia und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hermans, L., Kaynak, M., Braun, J. et al. Mikrotechnische Geräte ermöglichen die Langzeitbildgebung des ventralen Nervenstrangs bei sich verhaltenden erwachsenen Drosophila. Nat Commun 13, 5006 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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Eingegangen: 13. November 2021

Angenommen: 04. August 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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